Kutubxona (biologiya) - Library (biology)

Saytning to'yinganligi mutagenezi ning bir turi saytga yo'naltirilgan mutagenez. Ushbu rasm nazariy 10-qoldiq oqsilda bitta pozitsiyaning to'yingan mutagenezini ko'rsatadi. Oqsilning yovvoyi turi versiyasi yuqori qismida ko'rsatilgan bo'lib, M birinchi aminokislota metioninni, * esa tarjimaning tugashini anglatadi. 5-holatdagi izoletsinning barcha 19 mutantlari quyida keltirilgan.

DNK kutubxonalari qanday yaratiladi tasodifiy mutagenez namuna ketma-ketligi maydoni. Berilgan joyga almashtirilgan aminokislota ko'rsatilgan. Har bir nuqta yoki bog'langan nuqta to'plami kutubxonaning bitta a'zosi. Xatoga duch keladigan PCR tasodifiy ravishda boshqa aminokislotalarning ba'zi qoldiqlarini mutatsiyaga uchraydi. Alaninni skanerlash oqsilning har bir turg'unligini birma-bir alanin bilan almashtiradi. Saytning to'yinganligi 20 ta mumkin bo'lgan aminokislotalarning har birini (yoki ularning bir qismini) bitta pozitsiyada birma-bir almashtiradi.

Yilda molekulyar biologiya, a kutubxona jarayoni orqali mikroorganizmlar populyatsiyasida saqlanadigan va ko'payadigan DNK bo'laklari to'plamidir molekulyar klonlash. DNK kutubxonalarining har xil turlari, shu jumladan cDNA kutubxonalari (dan tashkil topgan teskari transkripsiya qilingan RNK ), genomik kutubxonalar (genomik DNKdan hosil bo'lgan) va randomizatsiyalangan mutant kutubxonalari (alternativ nukleotidlar yoki kodonlar kiritilgan de novo genlar sintezi bilan hosil qilingan). DNK kutubxonasi texnologiyasi oqimning asosiy tayanchidir molekulyar biologiya, gen muhandisligi va oqsil muhandisligi va ushbu kutubxonalarning qo'llanilishi asl DNK bo'laklarining manbasiga bog'liq. Da farqlar mavjud klonlash vektorlari va kutubxonani tayyorlashda ishlatiladigan usullar, lekin umuman har bir DNK bo'lagi klonlash vektoriga noyob tarzda kiritiladi va rekombinant DNK molekulalarining havzasi keyinchalik populyatsiyaga o'tkaziladi. bakteriyalar (a Bakterial sun'iy xromosoma yoki BAC kutubxonasi) yoki xamirturush, har bir organizm o'rtacha bitta konstruktsiyani o'z ichiga oladi (vektor + qo'shimchalar). Organizmlarning populyatsiyasi madaniy jihatdan ko'payganligi sababli, ularning tarkibidagi DNK molekulalari ko'chiriladi va tarqaladi (shu tariqa "klonlangan").

Terminologiya

"Kutubxona" atamasi organizmlarning populyatsiyasini anglatishi mumkin, ularning har biri klonlash vektoriga kiritilgan DNK molekulasini yoki muqobil ravishda klonlangan vektor molekulalarining barchasini to'plashni anglatadi.

cDNA kutubxonalari

A cDNA kutubxonasi ning namunasini ifodalaydi mRNA ferment yordamida DNK shabloniga qaytgan ma'lum bir manbadan (hujayralar to'plami, ma'lum bir to'qima yoki butun organizm) tozalangan. teskari transkriptaz. Shunday qilib, mRNK tozalanganida mavjud bo'lgan fiziologik, rivojlanish yoki atrof-muhit sharoitida ushbu manbada faol ravishda transkripsiyalangan genlarni ifodalaydi. cDNA kutubxonalari "to'liq metrajli" klonlarni targ'ib qiluvchi metodlardan foydalangan holda yoki identifikatsiyalash uchun ishlatiladigan qisqaroq fragmentlarni yaratadigan sharoitlarda yaratilishi mumkin. "ifodalangan ketma-ketlik teglari ".

cDNA kutubxonalari teskari genetikada foydalidir, ammo ular ma'lum bir organizmdagi umumiy genomning juda kichik (1% dan kam) qismini tashkil qiladi.

CDNA kutubxonalarining dasturlariga quyidagilar kiradi:

Yangi genlarning kashf etilishi
To'liq uzunlikdagi cDNA molekulalarini klonlash in vitro genlar funktsiyasini o'rganish
Turli hujayralar yoki to'qimalarda ifoda etilgan mRNKlarning repertuarini o'rganish
O'qish muqobil qo'shish turli hujayralar yoki to'qimalarda

Genomik kutubxonalar

A genomik kutubxona birgalikda ma'lum bir organizmning barcha genomini ifodalaydigan klonlar to'plamidir. Genomik kutubxonani tashkil etuvchi klonlar soni (1) ko'rib chiqilayotgan genomning kattaligiga va (2) o'ziga xos xususiyatiga ko'ra joylashtirilgan qo'shimchaning o'lchamiga bog'liq. klonlash vektori tizim. Ko'pgina amaliy maqsadlarda genomik DNKning to'qima manbai muhim emas, chunki tananing har bir hujayrasida deyarli bir xil DNK mavjud (ba'zi istisnolardan tashqari).

Genomik kutubxonalarning dasturlariga quyidagilar kiradi:

Berilgan organizmning to'liq genom ketma-ketligini aniqlash (qarang) genom loyihasi )
Genomning ketma-ketligi manbai bo'lib xizmat qiladi transgen hayvonlar orqali gen muhandisligi
Funktsiyasini o'rganish tartibga soluvchi ketma-ketliklar in vitro
O'qish genetik mutatsiyalar yilda saraton to'qimalar

Sintetik mutant kutubxonalari

Saytga yo'naltirilgan mutagenez kutubxonasini klonlashning umumiy usullaridan birini tasvirlash (ya'ni degenerat oligosidan foydalanish). Qiziqish geni shablonni mukammal ravishda to'ldiruvchi (ko'k) va shablondan bir yoki bir nechta nukleotidlar (qizil) bilan ajralib turadigan mintaqani o'z ichiga olgan oligos bilan PCRed. Bir-birini to'ldirmaydigan mintaqada degeneratsiyani o'z ichiga olgan ko'plab bunday primerlar bir xil PCR-ga to'planib, natijada ushbu mintaqada turli xil mutatsiyalarga ega bo'lgan turli xil PCR mahsulotlari paydo bo'ladi (quyida turli xil ranglarda ko'rsatilgan individual mutantlar).

Yuqorida tavsiflangan kutubxona turlaridan farqli o'laroq, variantli genlar kutubxonalarini yaratish uchun turli xil sun'iy usullar mavjud.^[1] Gen bo'yicha o'zgarish har ikkala tomonidan tasodifiy ravishda kiritilishi mumkin xatoga yo'l qo'yadigan PCR,^[2] DNKni aralashtirish o'xshash genlarning qismlarini birlashtirib,^[3] yoki transpozonga asoslangan usullarni joriy etish indels.^[4]Shu bilan bir qatorda, mutatsiyalar davomida ma'lum kodonlarga yo'naltirilishi mumkin de novo sintez yoki to'yinganlik mutagenezi bir yoki bir nechtasini qurish nuqtali mutantlar genning boshqariladigan usulida.^[5] Buning natijasida asl genning variantlarini ifodalovchi ikkita zanjirli DNK molekulalari aralashmasi paydo bo'ladi.

The ifoda etilgan keyinchalik ushbu kutubxonalardagi oqsillar qulay xususiyatlarni (masalan, barqarorlik, bog'lanish yaqinligi yoki ferment faolligi) namoyish etadigan variantlar bo'yicha tekshirilishi mumkin. Buni genlarning variantlarini yaratish va a tarkibidagi ekspression mahsulotlarini skrining tsikllarida takrorlash mumkin yo'naltirilgan evolyutsiya jarayon.^[1]

CDNA kutubxonasini tayyorlash texnikasi haqida umumiy ma'lumot

DNK ekstrakti

Agar mRNA kutubxonasini yaratadigan bo'lsak (ya'ni cDNA klonlari bilan), to'liq uzunlikdagi mRNA ajratish uchun bir nechta protokollar mavjud. Genomik DNK (shuningdek, gDNA deb nomlanadi) kutubxonalari uchun DNKni ajratib olish uchun DNK mini-preparati foydali bo'lishi mumkin.

Qo'shimchalarni tayyorlang

cDNA kutubxonalari mRNKning to'liq uzunlikdagi klonlarini cDNA sifatida olishini ta'minlash uchun ehtiyot bo'lishni talab qiladi (keyinchalik ular vektorlarga kiritiladi). Shu sababli 1-cDNA zanjiri va 2-cDNA zanjirining sintezini optimallashtirish hamda vektorga yo'naltirilgan klonlash uchun bir nechta protokollar ishlab chiqilgan.

GDNA fragmentlari ekstraksiya qilingan gDNA dan o'ziga xos bo'lmagan tez-tez kesuvchi cheklash fermentlari yordamida hosil bo'ladi.

Vektorlar

Nukleotidlar ketma-ketligi a ga qo'shimchalar sifatida saqlanib qoladi plazmid yoki a ning genomi bakteriyofag bakterial hujayralarni yuqtirish uchun ishlatilgan.

Vektorlar ko'pincha bakterial hujayralarda tarqaladi, ammo agar YAC (Xamirturush sun'iy xromosomasi) dan foydalansangiz, unda xamirturush hujayralaridan foydalanish mumkin. Vektorlarni viruslarda ham ko'paytirish mumkin edi, ammo bu ko'p vaqt va zerikarli bo'lishi mumkin. Shu bilan birga, viruslarni (ko'pincha fajlar) ishlatish natijasida yuqori transfektsiya samaradorligi ularni vektorni (bog'lab qo'yilgan qo'shimchali) qadoqlash va keyinchalik ularni bakterial (yoki xamirturush) hujayraga kiritish uchun foydali qiladi.

Bundan tashqari, cDNA kutubxonalari uchun Lambda Zap II faji, ExAssist va 2 E. coli turlaridan foydalangan holda tizim ishlab chiqilgan. Buning o'rniga loxP saytlaridan foydalanadigan Cre-Lox tizimi va rekombinaza fermentining in vivo ekspresiyasi ham ishlatilishi mumkin. Bu in vivo jonli eksizyon tizimlarining namunalari. In vitro eksizyon ko'pincha an'anaviy cheklash fermentlari va klonlash strategiyalari yordamida subklonlashni o'z ichiga oladi. In vitro eksizyon ko'p vaqt talab qilishi mumkin va in vivo jonli eksizyon tizimlariga qaraganda ko'proq "amaliy" ishni talab qilishi mumkin. Ikkala holatda ham, tizimlar vektorni fagdan jonli hujayraga ko'chirishga imkon beradi, bu erda vektor takrorlanishi va kutubxonadan foydalanishga qadar tarqalishi mumkin.

Kutubxonalardan foydalanish

Qiziqarli kimyoviy moddalarni ishlab chiqaradigan hujayralarni aniqlash uchun sintetik kutubxonani tekshirish uchun ish oqimi.

Bu qiziqish ketma-ketligi uchun "skrining" ni o'z ichiga oladi. Bunga erishish uchun bir necha usullar mavjud.

Adabiyotlar

^ ^a ^b Vajapey, Narendra; Lyu, Aleks Y.; Forloni, Matteo (2018-03-01). "Xatoga moyil bo'lgan DNK polimerazalaridan foydalangan holda tasodifiy mutagenez". Sovuq bahor porti protokollari. 2018 (3): pdb.prot097741. doi:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.
^ Makkullum, Yelizaveta O .; Uilyams, Berea A. R.; Chjan, Jinglei; Chaput, Jon C. (2010), Braman, Jeff (tahr.), "Xatoga moyil PCR tomonidan tasodifiy mutagenez", In Vitro Mutagenez protokollari: Uchinchi nashr, Molekulyar biologiya usullari, Humana Press, 634, 103-109 betlar, doi:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978
^ Krameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (yanvar 1998). "Turli xil turlarga mansub genlar oilasining DNK bilan aralashishi yo'naltirilgan evolyutsiyani tezlashtiradi" Tabiat. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998 yil natur.391..288C. doi:10.1038/34663. PMID 9440693.
^ Jones DD (2005 yil may). "Nishon genda tasodifiy pozitsiyalarda uchlik nukleotidlarni olib tashlash: TEM-1 beta-laktamazaning aminokislota yo'q qilinishiga bardoshliligi". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 33 (9): e80. doi:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.
^ Vang, Tian-Ven; Chju, Xu; Ma, Sin-Yuan; Chjan, Ting; Ma, Yu-Shu; Vey, Dong-Chji (2006-09-01). "Yo'naltirilgan molekulyar evolyutsiyada mutant kutubxonasi qurilishi". Molekulyar biotexnologiya. 34 (1): 55–68. doi:10.1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

Tashqi havolalar

[:0-1] Vajapey, Narendra; Lyu, Aleks Y.; Forloni, Matteo (2018-03-01). "Xatoga moyil bo'lgan DNK polimerazalaridan foydalangan holda tasodifiy mutagenez". Sovuq bahor porti protokollari. 2018 (3): pdb.prot097741. doi:10.1101 / pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.

[2] Makkullum, Yelizaveta O .; Uilyams, Berea A. R.; Chjan, Jinglei; Chaput, Jon C. (2010), Braman, Jeff (tahr.), "Xatoga moyil PCR tomonidan tasodifiy mutagenez", In Vitro Mutagenez protokollari: Uchinchi nashr, Molekulyar biologiya usullari, Humana Press, 634, 103-109 betlar, doi:10.1007/978-1-60761-652-8_7, ISBN 9781607616528, PMID 20676978

[3] Krameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (yanvar 1998). "Turli xil turlarga mansub genlar oilasining DNK bilan aralashishi yo'naltirilgan evolyutsiyani tezlashtiradi" Tabiat. 391 (6664): 288–91. Bibcode:1998 yil natur.391..288C. doi:10.1038/34663. PMID 9440693.

[4] Jones DD (2005 yil may). "Nishon genda tasodifiy pozitsiyalarda uchlik nukleotidlarni olib tashlash: TEM-1 beta-laktamazaning aminokislota yo'q qilinishiga bardoshliligi". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 33 (9): e80. doi:10.1093 / nar / gni077. PMC 1129029. PMID 15897323.

[5] Vang, Tian-Ven; Chju, Xu; Ma, Sin-Yuan; Chjan, Ting; Ma, Yu-Shu; Vey, Dong-Chji (2006-09-01). "Yo'naltirilgan molekulyar evolyutsiyada mutant kutubxonasi qurilishi". Molekulyar biotexnologiya. 34 (1): 55–68. doi:10.1385 / MB: 34: 1: 55. ISSN 1559-0305. PMID 16943572.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]