CDNKning tez kuchayishi tugaydi - Rapid amplification of cDNA ends

CDNKning tez kuchayishi tugaydi (PAYSI) - ishlatiladigan texnikadir molekulyar biologiya ning to'liq uzunlikdagi ketma-ketligini olish uchun RNK katakchadan topilgan. RACE natijalari a ishlab chiqarishga olib keladi cDNA orqali ishlab chiqarilgan qiziqishning RNK ketma-ketligi nusxasi teskari transkripsiya, dan so'ng PCR cDNA nusxalarini kuchaytirish (qarang RT-PCR ). Keyinchalik kuchaytirilgan cDNA nusxalari ketma-ketlikda joylashtiriladi va agar etarli bo'lsa, noyob genomik hududga mos kelishi kerak. RACE odatda dastlab individual RNK molekulalarini sekanslashdan oldin klonlash orqali kuzatiladi. Transkripsiyaning yangi tuzilmalarini aniqlash uchun foydali bo'lgan yuqori samaradorlikka ega alternativa - bu RACE mahsulotlarini keyingi avlodlar ketma-ketligi texnologiyalari bo'yicha ketma-ketlik qilish.

Jarayon

RACE RNK transkriptining ketma-ketligini transkript ichidagi ma'lum bo'lgan kichik ketma-ketlikdan to 5 'tugadi (5 'RACE-PCR) yoki 3 'oxiri RNK (3 'RACE-PCR). Ushbu uslub ba'zan chaqiriladi bir tomonlama PCR yoki langarli PCR.

RACE-dagi birinchi qadam - a hosil qilish uchun teskari transkripsiyadan foydalanish cDNA RNK transkripsiyasi mintaqasining nusxasi. Ushbu jarayonda transkriptning noma'lum so'nggi qismi ko'chirma markazidan ma'lum ketma-ketlik yordamida ko'chiriladi. Nusxalangan mintaqa 5 'yoki 3' oxirida ma'lum bo'lgan ketma-ketlik bilan chegaralanadi.

5 'yoki 3' RACES protokollari biroz farq qiladi. 5 'RACE-PCR mRNA dan cDNA sintezining birinchi davri uchun shablon sifatida foydalanishni boshlaydi (yoki teskari transkripsiya ) yordamida reaksiya sezgirlikka qarshi (teskari) oligonukleotid qiziqish geni o'rtasida ma'lum ketma-ketlikni tan oladigan primer; The astar deyiladi a genga xos primer (GSP). Primer mRNK bilan bog'lanadi va teskari transkriptaz fermenti o'ziga xos bir qatorli cDNA mahsulotini hosil qilish uchun primerning 3 'uchiga tayanch juftlarini qo'shadi; bu mRNKning teskari komplementidir. CDNK sintezidan so'ng ferment terminal deoksinukleotidil transferaza (TdT) bir xil qatorni qo'shish uchun ishlatiladi nukleotidlar, cDNA ning 3 'uchigacha gomopolimer quyruq deb nomlanadi. (De novo cDNA sintezining birinchi zanjiri uchun 3'-terminalli ketma-ketlikni qo'shishning boshqa usullari mavjud, ular gomopolimer qoldiqlariga qaraganda ancha samarali, ammo usulning ma'nosi bir xil bo'lib qoladi). PCR keyin ma'lum bo'lgan ketma-ketlikka bog'langan ikkinchi sezgirlikka qarshi genga xos primer (GSP2) va cDNAlarning 3 'uchlariga qo'shilgan homopolimerik dumni bog'laydigan sezgir (oldinga) universal primer (UP) ishlatilgan holda amalga oshiriladi. cDNA mahsulotini 5 'uchidan kuchaytirish uchun.

3 'RACE-PCR tabiiydan foydalanadi polyA quyruq teskari transkripsiya paytida primerlash uchun barcha ökaryotik mRNKlarning 3 'uchida mavjud, shuning uchun bu usul TdT tomonidan nukleotidlar qo'shilishini talab qilmaydi. cDNAlar an yordamida hosil bo'ladi Oligo-dT -adaptorli primer (deoksi-timin nukleotidlarining qisqa ketma-ketligi bo'lgan primer) polyA cho'zilib, har bir cDNA ning 5 'uchiga maxsus adapter ketma-ketligini qo'shadi. Keyinchalik PCR sezgir GSP yordamida ma'lum bir mintaqadan 3 'cDNA ni kuchaytirish uchun va adapter ketma-ketligini to'ldiruvchi anti-sens primer uchun ishlatiladi.

RACE-ketma-ketligi

The cDNA RACE tomonidan hosil qilingan molekulalar yordamida tartiblash mumkin yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi texnologiyalar (shuningdek, RACE-seq). RACE fragmentlarini yuqori o'tkazuvchanlik bilan ketma-ket tavsiflash juda vaqtni tejaydigan, sezgir, arzon va texnik jihatdan RACE fragmentlarini an'anaviy tavsiflash bilan taqqoslaganda molekulyar klonlash dan so'ng Sanger ketma-ketligi bir nechta klonlarning

Tarix va qo'llanmalar

RACE RNK ketma-ketligining bir qismi ma'lum bo'lgan va genga xos bo'lgan primer tomonidan yo'naltirilgan RNK molekulalarining noma'lum 5 '(5'-RACE) yoki 3' (3'-RACE) qismlarini kuchaytirish uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu kuchaytirilgan RACE mahsulotlarini tavsiflash uchun yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketligi bilan birgalikda har qanday kodlash yoki kodlamaydigan RNK-molekulalarni tavsiflash uchun yondashuvni qo'llash mumkin.

RACEni yuqori o'tkazuvchanlikni ketma-ketligi bilan birlashtirish g'oyasi birinchi marta 2009 yilda xaritalarni yaratish uchun Deep-RACE deb nomlangan. Transkripsiyani boshlash saytlari (TSS) bitta hujayra chizig'idagi 17 gendan iborat.[1] Masalan, 2014 yildagi sintetik yo'naltirilgan RNKning bo'linish joylarini aniq xaritalash bo'yicha olib borilgan tadqiqotda siRNAlar, yondashuv birinchi bo'lib RACE-seq deb nomlangan.[2] Bundan tashqari, metodologiya roman stenogrammalarining to'liq metrajli noma'lum qismlarini tavsiflash uchun ishlatilgan termoyadroviy transkriptlar yilda kolorektal saraton.[3] Boshqa bir tadqiqotda noma'lum transkript tuzilmalarini tavsiflashga qaratilgan lncRNAlar, RACE yarim uzunlik bilan birgalikda ishlatilgan 454 ketma-ketlik.[4]

Adabiyotlar

  1. ^ Olivarius, S; Plesi, C; Carninci, P (2009 yil fevral). "Deep-RACE tomonidan transkripsiyali boshlang'ich saytlarning yuqori o'tkazuvchanligini tekshirish" (PDF). Biotexnikalar. 46 (2): 130–2. doi:10.2144/000113066. PMID  19317658.
  2. ^ Denis, H; Moschos, SA; Sidders, B; Yuk, F; Perkins, H; Karter, N; Stroud, T; Kennedi, M; Fancy, SA; Lapthorn, C; Lavanta, H; Kinloch, R; Suhy, D; Corbau, R (2014 yil 4-fevral). "Terapevtik shRNA-ni qayta ishlash va siRNA-ning maqsadli parchalanish aniqligi bo'yicha chuqur ketma-ketlik tushunchalari". Molekulyar terapiya: Nuklein kislotalar. 3: e145. doi:10.1038 / mtna.2013.73. PMC  3951910. PMID  24496437.
  3. ^ Xof, AM; Yoxannessen, B; Alagaratnam, S; Chjao, S; Nom, T; Lyovf, M; Bakken, AC; Xektoen, M; Svin, A; Lothe, RA; Skotxaym, RI (2015 yil 3-noyabr). "Kolorektal saraton kasalligining yangi RNK variantlari". Onkotarget. 6 (34): 36587–602. doi:10.18632 / oncotarget.5500. PMC  4742197. PMID  26474385.
  4. ^ Lagard, Julien; Uszchinska-Ratayczak, Barbara; Santoyo-Lopes, Xaver; Gonsales, Xose Manuel; Tapanari, Electra; Mudj, Jonatan M.; Styuard, Charlz A .; Uilming, Lorens; Tanzer, Andrea; Xovald, Sedrik; Chrast, Jaklin; Vela-Boza, Alisiya; Rueda, Antonio; Lopez-Domingo, Fransisko J.; Dopazo, Xoakin; Reymond, Aleksandr; Gigo, Roderik; Harrow, Jennifer (2016 yil 17-avgust). "Odamlarning lncRNA transkriptlarini RACE tomonidan kengaytirilishi uzoq o'qilgan yuqori o'tkazuvchanlik sekansi (RACE-Seq) bilan birlashtirilgan". Tabiat aloqalari. 7: 12339. Bibcode:2016 yil NatCo ... 712339L. doi:10.1038 / ncomms12339. PMC  4992054. PMID  27531712.
  • Molekulyar klonlashda "5 'cDNA ning tez kuchaytirilishi tugaydi": Laboratoriya qo'llanmasi (tahr. Sambrook, J. & Russell, DW) 8-bob Protokoli 9, 8.54−8.60 (Cold Spring Harbor Laboratoriya Press, Cold Spring Harbor, Nyu-York , AQSh, 2001)
  • Genlarni manipulyatsiya qilish va genomika tamoyillari, S. B. Primrose va R. M. Twyman, Blackwell Publishing, 2006 (7-nashr), 111-12 betlar.

Tashqi havolalar