TOPO klonlash - TOPO cloning - Wikipedia

TOPO klonlash a molekulyar biologiya qaysi texnika DNK parchalar klonlangan aniq ichiga vektorlar uchun talablarsiz DNK ligazlari. Taq polimerazasi shablonga bog'liq bo'lmagan terminal transferaz faolligiga ega, bu esa PCR mahsulotlarining 3'-uchiga bitta deoksiadenozin (A) qo'shadi. Ushbu xususiyat TOPO TA klonlashda "yopishqoq uchi" dan foydalaniladi.[1] "To'mtoq uchli" TOPO klonlash uchun, qabul qiluvchi vektorda o'simtalar bo'lmaydi va to'mtoq DNK bo'laklari klonlanishi mumkin.

Printsip

Texnika o'ziga xos biologik faollikdan foydalanadi DNK topoizomerazasi I. Topoizomerazning biologik roli - bu yorilish va qo'shilish o'ralgan Replikatsiyani engillashtirish uchun DNK tugaydi. Vaccinia virusi topoizomeraza I DNK ketma-ketligini 5´- (C / T) CCTT-3 'ni aniq tan oladi. Davomida takrorlash, ferment DNKni aynan shu ketma-ketlikda hazm qiladi, DNKni echadi va uni yana 3 'fosfat guruhida bog'laydi. timidin tayanch.[1]

"Yopishqoq tugatish" TOPO TA klonlash

TOPO vektorlari shu tarzda ishlab chiqilganki, ular ushbu aniq ketma-ketlikni 5´- (C / T) CCTT-3 'ni ikkita chiziqli uchida o'tkazadilar. Lineer vektorli DNK allaqachon topoizomeraza fermentiga ega bo'lib, uning ikkala ipining "erkin 3" uchiga kovalent ravishda bog'langan. Keyinchalik bu PCR mahsulotlari bilan aralashtiriladi. PCR mahsuloti zanjirlarining bo'sh 5 'uchlari har bir vektor zanjirining topoizomeraza / 3' uchiga yopishganda, iplar allaqachon bog'langan topoizomeraza tomonidan kovalent ravishda bog'lanadi. Ushbu reaktsiya xona haroratida kerakli tuz bilan inkübe qilinganida samarali bo'ladi. Taq yoki Pfu polimeraza tomonidan kuchaytirilgan fragmentlarni klonlash uchun har xil turdagi vektorlardan foydalaniladi, chunki Taq polimerazasi (Pfu dan farqli o'laroq) kuchaytirish paytida 3-sonda qo'shimcha "A" nukleotidini qoldiradi.[1]

TA TOPO klonlash texnikasi turli DNK bo'laklaridagi adenin (A) va timin (T) (to'ldiruvchi bazepairs) ning gibridlanishiga va ligaza yoki topoizomeraza ishtirokida bir-biriga bog'lanib qolish qobiliyatiga tayanadi. Qo'shimchalar 3 'dan 5' gacha korrektor faolligi bo'lmagan va yuqori ehtimollik bilan PCR mahsulotining har bir uchiga bitta 3'-adenin qo'shimchasini qo'shadigan polimeraza Taq DNK polimeraza yordamida PCR yordamida yaratiladi. Agar PCR primerlarida 5 'uchida guaninlar bo'lsa yaxshi bo'ladi, chunki bu TN DNK polimerazasining terminal adenozinni qo'shib qo'yish ehtimolini maksimal darajada oshiradi. 3´ dan 5´ gacha bo'lgan ekzonukleaza faolligini o'z ichiga olgan termostabil polimerazalardan foydalanmaslik kerak, chunki ular 3 ´ adenin-o'simtani tark etmaydi, maqsadli vektor chiziqli bo'lib, uchi cheklangan ferment bilan kesilgan. Ushbu vektor keyinchalik terminal transferaz yordamida dideoksitimidin trifosfat (ddTTP) bilan biriktiriladi. Faqat bitta T qoldig'ining qo'shilishini ta'minlash uchun ddTTP-dan foydalanish muhimdir. Ushbu quyruq vektorni har bir to'mtoq uchida bitta 3'-osilgan timin qoldig'i bilan qoldiradi.[1]

TOP klonlash "to'mtoq tugatish"

TOPO klonlashda polimerazalar (masalan, Fusion) yoki to'mtoq uchlarni hosil qiladigan restriktiv fermentlardan ham foydalanish mumkin. TOPO vektorining yopishqoq uchlariga tayanish o'rniga, topoizomeraza molekulalari bog'langan joyida to'mtoq uchlari bor. Savdo to'plamlari, masalan, Invitrogen-dan Zero Blunt® Cloning Kit, mavjud.[2]

Adabiyotlar

  1. ^ a b v d "TOPO® klonlash texnologiyasi". Hayotiy texnologiyalar. Olingan 16 iyul 2014.
  2. ^ "Zero Blunt® klonlash to'plamlari". www.thermofisher.com.