Aminolil nukleotid - Aminoallyl nucleotide

Aminolil uridin (aa-UTP)

Aminolil nukleotid o'z ichiga olgan o'zgartirilgan asosga ega nukleotiddir allilamin. Ular post-etiketlashda ishlatiladi nuklein kislotalar tomonidan lyuminestsentsiya aniqlash mikroarray. Ular reaktivdir N-gidroksisuktsinimid biriktirishga yordam beradigan Ester guruhi lyuminestsent bo'yoq nukleotiddagi birlamchi amino guruhga. Ushbu nukleotidlar 5- (3-amino) deb nomlanadiallil ) -nukleotidlar, chunki aminoalil guruhi odatda uglerod 5 ga birikadi pirimidin halqa urasil yoki sitozin. Birlamchi omin aminoalil qismidagi guruh alifatik va shuning uchun to'g'ridan-to'g'ri halqalarga biriktirilgan amin guruhlariga nisbatan ancha reaktiv (aromatik ) asoslarning. Aminoalilning umumiy nomlari nukleozidlar dastlab aa- yoki AA- bilan qisqartirilib, aminoalilni bildiradi. 5-uglerodli shakar kichik "d" belgisi bilan yoki ko'rsatmasdan ko'rsatilgan dezoksiriboza agar kiritilgan bo'lsa yoki riboza Agar unday bo'lmasa. Nihoyat azotli asos va soni fosfatlar ko'rsatilgan (ya'ni aa-UTP = aminoalil uridin trifosfat ).

Tarix

Aa-dUTPs yordamida ierarxik klasterli issiqlik xaritasi[1]

Lyuminestsentsiya va nuklein kislotalarni birlashtirishning maqsadi bo'lmaganizotopik o'rganish uchun aniqlanadigan yorliq DNK yoki RNK. Ushbu turdagi yorliq olimlarga DNK yoki RNKni ularning tuzilishi, funktsiyasi yoki shakllanishida boshqa nuklein kislotalar bilan o'rganishga imkon beradi.[2] Floresan yorlig'i uchun birinchi bazaviy o'zgartirish 1971 yilda sodir bo'lgan 4-tiouridin va 4-tiourasil.[3] Ushbu tadqiqot to'g'ridan-to'g'ri va to'g'ridan-to'g'ri bo'lmagan etiketlashning har xil turlarini o'z ichiga olgan boshqalar bilan bir qatorda: analoglar, fermentlar yoki boshqa usullar bilan qo'shib qo'yish nukleotidlarni markalashni olim uchun DNKni o'rganishda ancha xavfsiz qildi.[2]

Sifatida asbobsozlik va texnologiyalar yanada rivojlanganligi sababli DNK mikroarray, keyingi ilmiy tadqiqotlar uchun yaxshiroq reaktivlar va texnikalar kerak bo'ladi. Bilan lyuminestsent yorliqlash Cy3 natijalari ancha pastligi va qiyshiqligi ko'rsatildi; o'rniga aminoalil nukleotid qo'shilish usuli tanlangan. Bilvosita lyuminestsent yorliq sifatida aminolil nukleotidlaridan foydalanish sezuvchanlik masalalarini bekor qilganga o'xshaydi siyanin markirovkasi.[4]

Sintez

Aminolil nukleozidlar bolishi mumkin sintez qilingan orqali Hek bilan bog'lanish quyidagi rasmda ko'rsatilgandek.[5]

Aminolil nukleotid reaktsiyasini birlashtirish

Yuqoridagi rasmda chap tomonda an bilan o'zgartirilgan nukleosid mavjud yod (yod orqali qo'shiladi elektrofil galogenlash ) pirimidin halqasidagi beshinchi uglerodda. Uning hosil bo'lishi allilamin bilan reaktsiya bilan bog'liq bo'lishi mumkin va turli xil reaktivlar heck birikmasi yordamida halogen guruhdan chiqarib, allilaminni qo'shib, o'ngda ko'rsatilgan aminolil nukleosidga aylantiradi.[5] Keyin o'ngdagi mahsulot ichkariga kirish uchun ishlatiladi molekulyar biologiya RNK sintezida.[4][6][7]

Boshqa reaktsiyalarga a dan foydalanish kiradi bitta pot sintezi boshqalari bilan galogenlar.[8]

Reaksiya

Aminolil nukleotididagi birlamchi amin amino-reaktiv bo'yoqlar bilan reaksiyaga kirishadi [9] kabi a siyanin va patentlangan bo'yoqlar[10][11] tarkibida reaktiv chiqib ketish guruhi, masalan, sukkinimidil Ester (NHS To'g'ridan-to'g'ri halqa bilan biriktirilgan amin guruhlari ta'sir qilmaydi. Ushbu nukleotidlar DNKni markalash uchun ishlatiladi.[4][6][10][11][12]

O'zgartirilgan siydikni belgilash

Foydalanadi

Aminolil NTPlari bilvosita DNK belgilarini kiritish uchun ishlatiladi PCR, nik tarjimasi, primer kengaytmalari va cDNA sintez.[13] Ushbu yorliqli NTPlar molekulyar biologiya laboratoriyalarida qo'llanilishi sababli foydalidir, chunki ular radioaktiv material bilan ishlash qobiliyatiga ega emas. Masalan, 5- (3-Aminoalil) -Uridin (AA-UTPs) DNKning yuqori yorlig'i uchun DNKni oldindan belgilashga qaraganda samaraliroq. NTPlarning fermentativ qo'shilishidan so'ng, DNK molekulasini aniqlash uchun amin reaktivli lyuminestsent bo'yoqlar qo'shilishi mumkin.[7] DNK / RNK tomonidan DNK yoki RNK molekulalariga qo'shilganda polimeraza, 5- (3-aminoalil) -UTP boshqa kimyoviy guruhlarni qo'shish uchun reaktiv guruhni ta'minlaydi. Shunday qilib, aminolil modifikatsiyalangan DNK yoki RNK amin-reaktiv guruhga ega bo'lgan har qanday birikma bilan belgilanishi mumkin.aa-NTPlar DNK / RNKga qo'shilib, ikkilamchi bo'yoq biriktiruvchi reagentlari bilan birgalikda massivni tahlil qilish uchun tekshirishi mumkin.[6]

cDNA aniqlash maqsadida aminolil markirovkasiga asoslanadi. DNTP ning to'g'ridan-to'g'ri yorlig'i lyuminestsent markirovkalashning eng tezkor va eng arzon usuli bo'lsa-da, ammo bu ketma-ketlik faqat bitta modifikatsiyalangan nukleotiddan foydalanishga imkon beradiganligi sababli foydasizdir. To'g'ridan-to'g'ri markirovkalashning yana bir kamchiligi bu katta hajmli nukleotidlardir, ammo buni aminolil modifikatsiyalangan nukleotidlar yordamida bilvosita etiketlash orqali bartaraf etish mumkin.[14] Muvaffaqiyatni tekshirishning oson usuli bu rang; Yaxshi etiketlash natijasida yakuniy materialda ko'rinadigan ko'k (Cy5) yoki qizil (Cy3) rang paydo bo'ladi.[15]

CDNA etiketli amino-allilni tayyorlash jarayoni

Aminolil markirovkasini ishlatadigan yana bir jarayon NASBA (Nuklein kislota ketma-ketligiga asoslangan amplifikatsiya), RNKni kuchaytirish uchun juda sezgir usul. Ushbu o'ziga xos holatda, aaUTP modifikatsiyalangan RNKlari Cy3 lyuminestsent bozori bilan etiketlandi. NASBA aminoallil-UTP yorlig'i bilan birgalikda atrof-muhit monitoringi, bio xavfni aniqlash, sanoat jarayonini kuzatish va klinik mikrobiologiya kabi mikrobial diagnostikaning turli sohalari uchun juda foydali.[16] DNK mikroarraysi - bu AA-NTP ning DNK mikroarray sinovlarini tezroq va arzonroq qilishda foydalanadigan yana bir usul.[12]

Post-sintez yorlig'i bir xil yoritish samaradorligi bilan zondlar ishlab chiqarish orqali Cy-etiketli dNTPlarning to'g'ridan-to'g'ri fermentativ qo'shilishidagi muammolardan qochadi. Bilvosita etiketlash bilan amin bilan modifikatsiyalangan NTPlar qo'shiladi teskari transkripsiya, RNKni kuchaytirish yoki PCR. Amino alil-NTPlar polimerizatsiya paytida modifikatsiyalanmagan NTPlar kabi samaradorlikka ega.[17][18]

Yorliq bilan bog'liq muammolar: Aminolil-modifikatsiyalangan nukleotid tarkibidagi amin guruhi siyanin seriyali yoki boshqa patentlangan bo'yoqlar kabi bo'yoqlar bilan reaktivdir. Bo'yoqlar reaksiyaga kirishganda muammo paydo bo'ladi tamponlovchi vositalar nukleotidlarni to'g'ri saqlash uchun zarur bo'lgan. Biroq, bu muammoni bartaraf etish uchun karbonat tamponidan foydalanish mumkin.[19]

Shuningdek qarang

Adabiyotlar

  1. ^ Xogen, Deniel J.; Riordan, Daniel P.; Gerber, Andre P.; Xerslag, Doniyor; Braun, Patrik O. (2008). "Turli xil RNK-bog'laydigan oqsillar funktsional jihatdan bog'liq bo'lgan RNK to'plamlari bilan o'zaro ta'sir qiladi va keng ko'lamli tartibga solish tizimini taklif qiladi". PLOS biologiyasi. 6 (10): e255. doi:10.1371 / journal.pbio.0060255. PMC  2573929. PMID  18959479.
  2. ^ a b Kricka, LJ; Fortina, P (2009 yil aprel). "Analitik ajdodlar: nukleozidlar, nukleotidlar va nuklein kislotalarning lyuminestsent yorliqlarida" birinchi ". Klinik kimyo. 55 (4): 670–83. doi:10.1373 / clinchem.2008.116152. PMID  19233914.
  3. ^ Secrist III, Jon A.; Xorxe R. Barrio; Nelson J. Leonard (1971 yil 3-dekabr). "4-tiourasil va 4-tiouridinga lyuminestsent yorliqni yopishtirish". Biokimyoviy va biofizik tadqiqotlari. 45 (5): 1262–1270. doi:10.1016 / 0006-291x (71) 90154-9. PMID  4332594.
  4. ^ a b v Farrel, Robert (2010-07-22). RNK metodikasi: ajratish va tavsiflash bo'yicha laboratoriya qo'llanmasi. p. 597. ISBN  9780080454764.
  5. ^ a b Reddington, Mark; Daniel Kanningan-Brayant (2011 yil 12-yanvar). "(E) -5-aminoalil-2′-deoksitsitidin va unga bog'liq ba'zi hosilalarning qulay sintezi". Tetraedr xatlari. 52 (2): 181–183. doi:10.1016 / j.tetlet.2010.10.137.
  6. ^ a b v Biosistemalar, Amaliy. "O'zgartirilgan nukleotid 5- (3-aminolil) -UTP" (PDF).
  7. ^ a b Biotexnologiya, Trilink. "O'zgartirilgan nukleotidlar" (PDF).
  8. ^ Kore, Anilkumar R .; Bo Yang; Balasubramanian Srinivasan (2013 yil 13-noyabr). "(E) -5- [3-Aminolil] -uridin-5′-trifosfatning florali yordamli sintezi". Tetraedr xatlari. 54 (46): 6264–6266. doi:10.1016 / j.tetlet.2013.09.026.
  9. ^ DeRisi, Jozef. "Amino-allil bo'yoqlarini biriktirish protokoli" (PDF). Olingan 9 aprel 2014.
  10. ^ a b AnaSpec, Inc. "Hiyte Fluor risolasi" (PDF). Arxivlandi asl nusxasi (PDF) 2014 yil 13 aprelda. Olingan 9 aprel 2014.
  11. ^ a b hayot texnologiyalari. "Aminoallyl dUTP". Olingan 24 mart 2014.
  12. ^ a b Sian, CC; Kozhich, OA; Chen, M; Inman, JM; Phan, QN; Chen, Y; Braunshteyn, MJ (Jul 2002). "DNK mikroarjimalari uchun problarni belgilash uchun amin modifikatsiyalangan tasodifiy primerlar". Tabiat biotexnologiyasi. 20 (7): 738–42. doi:10.1038 / nb0702-738. PMID  12089562.
  13. ^ Gibriel, Abdulloh (2012 yil 17 aprel). "DNK mikro-massivlarga asoslangan aniqlash usullarida nuklein kislota namunalarini etiketlash uchun imkoniyatlar mavjud". Funktsional Genomika bo'yicha brifinglar. II (4): 311–318. doi:10.1093 / bfgp / els015. PMID  22510454.
  14. ^ Yashil, Maykl. "Molekulyar klonlash - laboratoriya qo'llanmasi". Sovuq bahor porti laboratoriyasining matbuoti.
  15. ^ Ott, Scheler; Barri Glinn (2009). "Mikroarray dasturlari uchun NASBA kuchaytirilgan tmRNA molekulalarining lyuminestsent yorlig'i". BMC biotexnologiyasi.
  16. ^ Hoen, Pensilvaniya; de Kort, F; van Ommen, GJ; den Dunnen, JT (2003 yil 1-mart). "Mikroarray dasturlari uchun kRNKning lyuminestsent yorlig'i". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 31 (5): e20. doi:10.1093 / nar / gng020. PMC  149842. PMID  12595569.
  17. ^ Kaposi-Novak, P; Li, JS; Mikaelyan, A; Patel, V; Thorgeirsson, SS (2004 yil oktyabr). "Chiziqli RNK amplifikatsiyasidan aminolil bilan belgilangan cDNA nishonlarini oligonukleotidli mikroarray tahlil qilish". Biotexnikalar. 37 (4): 580, 582–6, 588. doi:10.2144 / 04374ST02. PMID  15517970.
  18. ^ Ovozli, P; Uiler, C .; Latham, H. (2001). "CyScribe Post-Labeling Kit yordamida aminolill usulida mikroarrayli gibridlash uchun yuqori lyuminestsent, teng ravishda etiketli zondlarni tayyorlash". Hayotshunoslik yangiliklari. 9: 17–19.

Tashqi havolalar

  • Namunaviy protokol Xolli Bennet va Djo DeRisi tomonidan Kriz Seidel tomonidan o'zgartirilgan "Rosetta Informatics" da paydo bo'lgan.[1]
  1. ^ Zeydel, Kris. "Floresan probini tayyorlash". Olingan 24 mart 2014.