Bioreporter - Bioreporter

Bioreporter organizm anatomiyasi. Muayyan analitik ta'sirida promotor / reporter gen kompleksi xabarchi RNKga (mRNK) transkripsiya qilinadi va keyinchalik signal ishlab chiqarish uchun javobgar bo'lgan muxbir oqsiliga tarjima qilinadi.

Bioreporters buzilmagan, tirik mikrobial hujayralar bo'lgan genetik jihatdan yaratilgan ularning tarkibidagi ma'lum bir kimyoviy yoki fizik agentga javoban o'lchovli signalni ishlab chiqarish atrof-muhit. Bioreportatorlar ikkita muhim genetik elementni o'z ichiga oladi, a targ'ibotchi gen va a muxbir gen. Promouter geni yoqilgan (ko'chirildi ) maqsad agent hujayra muhitida bo'lganida. Oddiy bakterial hujayradagi promotor gen boshqa genlar bilan bog'lanadi, keyinchalik ular transkripsiyalanadi va keyin hujayraga ta'sir qilgan agent bilan kurashishda yoki unga moslashishda yordam beradigan oqsillarga tarjima qilinadi. Biyoreporter bo'lsa, bu genlar yoki ularning qismlari olib tashlandi va ularning o'rniga reportyor geni almashtirildi. Binobarin, promouter genini yoqish reportyor genining yoqilishini keltirib chiqaradi. Reporter genining faollashishi reportyor ishlab chiqarishga olib keladi oqsillar oxir-oqibat aniqlanadigan signalning bir turini hosil qiladi. Shuning uchun signalning mavjudligi bioreporter o'z muhitida ma'lum bir maqsad agentini sezganligini ko'rsatadi.

Dastlab ta'sir ko'rsatadigan omillarni fundamental tahlil qilish uchun ishlab chiqilgan gen ekspressioni, bioreportatorlar atrof muhitni ifloslantiruvchi moddalarni aniqlash uchun erta murojaat qilishgan[1] va keyinchalik turli xil sohalarga aylandi tibbiy diagnostika, aniq qishloq xo'jaligi, oziq-ovqat xavfsizligi kafolat, jarayonni monitoring qilish va nazorat qilish va bio-mikroelektronik hisoblash. Ularning ko'p qirraliligi juda ko'p sonli mavjudligidan kelib chiqadi muxbir gen turli xil signallarni ishlab chiqarishga qodir bo'lgan tizimlar. Bundan tashqari, muxbir genlari genetik ravishda kiritilishi mumkin bakterial, xamirturush, o'simlik va sutemizuvchi hujayralarni o'z ichiga oladi va shu bilan keng ko'lamli xost vektorlari bo'yicha sezilarli funktsiyalarni ta'minlaydi.

Reporter gen tizimlari

Biyoreporter organizmlarni qurishda reporter genlarning bir nechta turlari mavjud va ular yaratadigan signallarni odatda ikkiga ajratish mumkin kolorimetrik, lyuminestsent, lyuminestsent, kimyoviy nurlanish yoki elektrokimyoviy. Garchi ularning har biri boshqacha funktsiyalarga ega bo'lsa-da, ularning yakuniy mahsuloti har doim bir xil bo'lib qoladi - ular ta'sirlangan noyob kimyoviy yoki fizik agent konsentratsiyasiga mutanosib bo'lgan o'lchovli signal. Ba'zi hollarda signal faqat ikkilamchi bo'lganda paydo bo'ladi substrat ga qo'shiladi bioassay (lyuksAB, Luc va aequorin). Boshqa bioreportatorlar uchun signal tashqi yorug'lik manbai (GFP va UMT) bilan faollashtirilishi kerak, va tanlangan bir nechta bioreportatorlar uchun signal butunlay o'z-o'zidan paydo bo'ladi, ekzogen substrat yoki tashqi faollashtirish talab qilinmaydi (lyuksCDABE). Keyingi bo'limlarda muxbirlarning ba'zi gen tizimlari va ularning amaldagi qo'llanmalari haqida qisqacha ma'lumot berilgan.

Bakterial lusiferaza (lyuks)

Bakterial lusiferaza uchun genlarni o'z ichiga olgan mikrob hujayralari koloniyalaridan chiqadigan biolyuminesans.

Lusiferaza uchun umumiy ism ferment bu kataliz qiladi yorug'lik chiqaradigan reaktsiya. Lusiferazalar bakteriyalar, suv o'tlari, zamburug'lar, meduzalar, hasharotlar, qisqichbaqalar va kalamarlarda uchraydi va natijada bu organizmlar ishlab chiqaradigan yorug'lik biolyuminesans deb ataladi. Bakteriyalarda yorug'lik chiqaradigan reaktsiya uchun javob beradigan genlar ( lyuks genlar) ajratilgan va 490 nm maksimal intensivlik bilan ko'k-yashil chiroq chiqaradigan bioreportorlarni qurishda keng foydalanilgan.[2] Uch variant lyuks mavjud, biri <30 ° C da, ikkinchisi <37 ° C da, uchinchisi <45 ° C da ishlaydi. The lyuks genetik tizim beshta gendan iborat, lyuksA, lyuksB, lyuksC, lyuksDva lyuksE. Ushbu ishlatiladigan genlarning kombinatsiyasiga qarab, bir nechta turli xil turlari biolyuminestsent bioreportatorlar tuzilishi mumkin.

lyuksAB Bioreporters

lyuksAB bioreportatorlar faqat o'z ichiga oladi lyuksA va lyuksB genlar, ular birgalikda yorug'lik signalini ishlab chiqarish uchun javobgardir. Biroq, yorug'lik chiqaradigan reaktsiyani to'liq bajarish uchun, a substrat kameraga etkazib berilishi kerak. Odatda, bu kimyoviy qo'shilish orqali sodir bo'ladi dekanal bioassay protsedurasi paytida bir nuqtada. Ko'p sonli lyuksAB bioreportatorlar bakteriyalar, xamirturushlar, hasharotlar, nematodalar, o'simliklar va sutemizuvchilar hujayralari tizimida qurilgan.

lyuksCDABE Bioreporters

Buning o'rniga faqat lyuksA va lyuksB genlar, bioreportatorlar beshtasini o'z ichiga olishi mumkin genlar ning lyuks kasseta, shu bilan substratning begona qo'shimchalarini va hech qanday qo'shimchalarni talab qilmaydigan butunlay mustaqil yorug'lik hosil qiluvchi tizimni yaratishga imkon beradi. hayajon tashqi yorug'lik manbai bilan. Shunday qilib, ushbu bioassayda bioreporter shunchaki nishonga duch keladi analitik va a miqdoriy biolyuminesans natijalarining ko'payishi, ko'pincha bir soatdan kam vaqt ichida. Tezligi va ishlatilish qulayligi tufayli biosayni takroriy ravishda bajarish qobiliyati bilan birga haqiqiy vaqt va on-layn, ishlab chiqaradi lyuksCDABE bioreportatorlar juda jozibali. Binobarin, ular atrof muhitni ifloslantiruvchi moddalarni sezishdan tortib, tirik sichqonlarda patogen infektsiyalarni real vaqtda kuzatishga qadar bo'lgan turli xil aniqlash metodologiyalariga kiritilgan.

Nonspesifik lyuks Bioreporters

Nonspesifik lyuks bioreportatorlar odatda kimyoviy toksinlarni aniqlash uchun ishlatiladi. Ular odatda doimiy ravishda biolyuminesans uchun mo'ljallangan. Kimyoviy toksin ta'sirida hujayra o'ladi yoki uning metabolizm faolligi sustlashadi, bu esa pasayishiga olib keladi biolyuminestsent yorug'lik darajasi. Ularning eng taniqli dasturi Microtox-da [1] namunaning bir necha konsentratsiyasiga qisqa ta'siridan so'ng kamaygan joyni tahlil qiling biolyuminesans ning nisbiy darajalari bilan o'zaro bog'liq bo'lishi mumkin toksiklik.[3]

Firefly luciferase (Luc)

Firefly lusiferaza 550 - 575 nm oralig'ida ko'rinadigan yorug'lik hosil qiluvchi reaktsiyani katalizlaydi. 595 nm ga yaqin cho'qqida yorug'lik hosil qiladigan klik-qo'ng'iz lusiferazasi ham mavjud. Ikkala lyusiferaza ham yorug'lik reaktsiyasi paydo bo'lishi uchun ekzogen substrat (lusiferin) qo'shilishini talab qiladi. Ko'p sonli luckeng massivni aniqlash uchun asosli bioreportatorlar qurilgan noorganik va organik birikmalar ekologik muammo. Biroq, eng istiqbolli dasturlar, ehtimol, o't pufagi lusiferazasining genetik kodini boshqa ökaryotik hujayralar va to'qimalarga kiritishga ishonadi.

Tibbiy diagnostika

Qo'shilishi luc insonning bo'yin bachadon karsinomasi hujayralari qatoriga genlar (HeLa ) o'simta hujayralarining tozalanishini tirik sichqonchada shunchaki a yordamida skanerlash orqali ko'rish mumkinligi tasvirlangan zaryad bilan bog'langan qurilma kamera, bunga imkon beradi kimyoviy terapiya on-layn rejimida va real vaqt rejimida davolanishni tezda nazorat qilish.[4] Boshqa bir misolda luc potentsialga ega moddalarni aniqlash va o'lchash uchun bioassayni ishlab chiqish uchun genlar insonning ko'krak bezi saraton hujayralari qatoriga kiritilgan estrogenik va antiestrogen faolligi.[5]

Genlarni tartibga solish bo'yicha tadqiqotlar

Xususan targ'ibotchilar ning yuqori qismida joylashtirilishi mumkin luc gen, ya'ni luc ketma-ketlikni DNK darajasida promotor ketma-ketligi bilan birlashtirish mumkin. Agar bunday konstruktsiya hajmi jihatidan unchalik katta bo'lmasa, uni shunchaki eukaryotik hujayralarga kiritish mumkin plazmidlar. Ushbu yondashuv ma'lum bir promotorning ma'lum bir hujayra / to'qima turidagi faoliyatini o'rganish uchun keng qo'llaniladi, chunki lusiferaza tomonidan ishlab chiqariladigan yorug'lik miqdori promotor faolligi bilan to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir.[6] Promoteratorlarni o'rganishdan tashqari, o't pufagi lusiferaza tahlillari o'rganish imkoniyatini beradi transkripsiya aktivatorlari: bu tajribalarda odatda GAL4 / UAS_sistemasi ishlatiladi va uning Gal4 yuqori oqimida faollashtiruvchi DNK ketma-ketligi (UAS) oqimning yuqorisida joylashtirilgan luc gen, shu bilan birga har xil aktivatorlar yoki bir xil aktivatorning turli xil variantlari / bo'laklari oqsil darajasida GAL4 DNKni bog'lash moduli bilan birlashtirilgan. Shunday qilib, turli xil GAL4 termoyadroviy oqsillarining transkripsiyaviy faolligini yorug'lik sifatida o'qish sifatida to'g'ridan-to'g'ri solishtirish mumkin.[7]

Ekvorin

Ekvorin biolyuminescent meduzadan ajratilgan fotoprotein Aequorea victoria. Qo'shilganidan keyin kaltsiy ionlari (Ca2 +) va koelenterazin, reaktsiya paydo bo'ladi, natijada 460 - 470 nm oralig'ida ko'k nur hosil bo'ladi. Aequorin inson tarkibiga kiritilgan B xujayrasi aniqlash uchun chiziqlar patogen bakteriyalar va viruslar Hujayra CANARY tahlil (Uyali tahlil va antigen xatarlari va rentabelligi to'g'risida xabar berish).[8] B hujayralari genetik jihatdan aekorin hosil qilish uchun yaratilgan. Turli xil patogenlarning antigenlari ta'sirida rekombinant B hujayralari hujayra ichidagi kaltsiy ionlarini chiqaradigan hujayra ichidagi signal kaskadining faollashishi natijasida yorug'lik chiqaradi.

Yashil lyuminestsent oqsil (GFP)

Yashil lyuminestsent oqsil (GFP) - bu meduzadan ajratilgan va klonlangan fotoprotein Aequorea victoria.[9] Variantlar, shuningdek, dengiz pansiyasidan ajratilgan Renilla reniformis. GFP, ekvorin kabi, ko'k rangli lyuminestsent signalni ishlab chiqaradi, ammo ekzogen substratning kerakli qo'shilishisiz. Faqat bitta talab qilinadi ultrabinafsha nur fotoproteinning floresan xususiyatlarini faollashtirish uchun manba. Ushbu avtofluoresans qobiliyati GFP ni biosensiya tahlillarida juda kerakli qiladi, chunki u on-layn rejimda va buzilmagan, tirik hujayralarni kuzatishda ishlatilishi mumkin. Bundan tashqari, GFPni ko'k (shuningdek, ko'k, qizil va sariq) dan tashqari yorug'lik chiqindilarini ishlab chiqarish uchun o'zgartirish qobiliyati uni multianalit detektori sifatida ishlatishga imkon beradi. Binobarin, GFP bakterial, xamirturush, nematod, o'simlik va sutemizuvchilar xostlaridagi bioreporter konstruktsiyalarida keng qo'llanilgan.

Uroporfirinogen (urogen) III metiltransferaza (UMT)

Uroporfirinogen (urogen) III metiltransferaza (UMT) ikkitasini beradigan reaktsiyani katalizlaydi lyuminestsent 590 - 770 nm oralig'ida qizil-to'q sariq rangli lyuminestsentsiya ishlab chiqaradigan mahsulotlar ultrabinafsha nur.[10] Shunday qilib, GFPda bo'lgani kabi, ekzogen substratlarni qo'shish talab qilinmaydi. UMT rekombinantni tanlash uchun bioreporter sifatida ishlatilgan plazmidlar, gen uchun marker sifatida transkripsiya bakterial, xamirturush va sutemizuvchilar hujayralarida va kabi toksik tuzlarni aniqlashda arsenit va antimonit.

Izohlar

  1. ^ King, J.M.H. va boshq. (1990) Naftalan ta'sir qilish va biodegradatsiya uchun tezkor, sezgir biolyuminesans muxbir texnologiyasi. Ilmiy 249, 778-781.http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/249/4970/778?ck=nck
  2. ^ Meighen, E.A. (1994) Bakterial biolyuminesans genetikasi. Annu. Rev. Genet. 28, 117-139. http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.ge.28.120194.001001
  3. ^ Hermens, J. va boshq. (1985) Photobacterium phosphoreum tarkibidagi organik kimyoviy moddalarning miqdoriy tuzilish-faollik munosabatlari va aralashmaning toksikligi: Microtox testi. Ekotoksikol. Atrof. Xavfsiz 9, 17-25. https://doi.org/10.1007%2Fs11434-006-2168-z
  4. ^ Kontag, C.H. va boshq. (2000) in vivo jonli ravishda neoplastik kasallikning optik o'lchovlari uchun reportyor genlaridan foydalanish. Neoplaziya 2 (1-2), 41-52. http://neoreviews.aappublications.org/cgi/content/extract/1/12/e225
  5. ^ Legler, J. va boshq. (1999) Insonning T47D ko'krak bezi saratoni hujayralarida barqaror transfekte qilingan estrogen retseptorlari vositasida lusiferaza reporterining gen tahlilini ishlab chiqish. Toksikol. Ilmiy ish. 48 (1), 55-66. http://toxsci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/48/1/55
  6. ^ Kovach KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (sentyabr 2006). "C / EBPbeta juftligi dopaminni P moddasiga signal berish, striatal neyronlarda gen ekspresiyasi". Neyrokimyo jurnali. 98 (5): 1390–9. doi:10.1111 / j.1471-4159.2006.03957.x. PMID  16771829.
  7. ^ Kovach KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (noyabr 2015). "CREB-bog'lovchi oqsilni gomeodomain bilan ta'sir qiluvchi oqsil kinaz 2 tomonidan kompleks tartibga solish" (PDF). Uyali signalizatsiya. 27 (11): 2252–60. doi:10.1016 / j.cellsig.2015.08.001. PMID  26247811.
  8. ^ Rider, T. va boshq. (1999) NASA / NCI biomedikal ko'rish simpoziumida.
  9. ^ Misteli, T. va Spektor, D.L. (1997) Yashil lyuminestsent oqsilni hujayra biologiyasi va biotexnologiyasida qo'llash. Nat. Biotexnol. 15, 961-964.
  10. ^ Sattler, I. va boshq. (1995) Propionibacterium freudenreichii (shermanii) ning uroporfirinogen-III metiltransferaza kobA genini klonlash, ketma-ketligi va ekspressioni. J. Bakteriol. 177, 1564-1569.http://jb.asm.org/cgi/content/abstract/177/6/1564