G-kam kasseta - G-less cassette

The G-kam kasseta transkripsiyani tahlil qilish - bu ishlatiladigan usul molekulyar biologiya aniqlash uchun targ'ibotchi kuch in vitro. Texnika plazmid yordamida mRNA mahsulotining miqdorini aniqlashni o'z ichiga oladi.[1] G-kamroq kasseta oldindan tuzilgan vektorning bir qismidir, odatda a ni o'z ichiga oladi bir nechta klonlash sayti (MCS) kassetaning yuqori qismida. Shu sababli, transkripsiya mexanizmlarini jalb qilishda promouterning aniqligi va samaradorligini o'lchash uchun qiziqtiradigan promouterlarni to'g'ridan-to'g'ri MCSga kiritish mumkin.

Promouter klonlanadi
G-kam kassetali plazmid.
(a) 365 ntlik G-kamroq sezgirlik zanjiri bilan oldindan tayyorlangan plazmid promouterni kiritishga duchor bo'ladi. (b) Promouter transkripsiyani boshlash joyining darhol yuqori qismida bir nechta klonlash joyiga (MCS) klonlanadi. G-kamroq kassetani transkripsiyalashda polimeraza ishlatiladi. Kasseta transkripsiyasi o'tkazilgandan va kassetadan tashqaridagi ma'noda birinchi guanosin trifosfat aniqlangandan so'ng, transkriptsiya muddatidan oldin tugatiladi. Radioaktiv yorliqli 365-nt transkript chiqarildi. G-kamroq kassetali tahlilda ishlab chiqarilgan transkriptlar nisbiy promouter kuchini aniqlash uchun ularning uzunligini va avtoradiografiyasini tasdiqlash uchun gel elektroforeziga duch kelishi mumkin.

Usul

G-kamroq kaset a muxbir gen transkriptni etishmayotganini kodlaydi guanin nukleotidlar sezgi DNK zanjiri (shu sababli "G-Kamroq").[2] Bunday genni o'z ichiga olgan plazmid MCS ning quyi qismida joylashgan. Promouter MCSga kiritilgandan so'ng, transkripsiya radioelementli UTP, CTP va ATP qo'shilishi bilan (shuningdek, radioaktiv yorliqli bo'lmagan / sovuq nukleotidlar) davom etadi va G-kam kassetaning oxirigacha davom etadi va guanin qoldiqlari DNKning ma'no zanjirida yana bir bor namoyon bo'ladi . GTP yo'qligi in vitro natijada transkriptsiya birinchi guanin qoldig'ida kassetadan keyingi ma'no zanjirida muddatidan oldin tugatiladi. Jel elektroforezi transkripsiyasi bo'yicha mahsulotlarda amalga oshiriladi va radioaktivlik miqdori bilan belgilanadi avtoradiografiya yoki fosforimaging qiziqish targ'ibotchining kuchini aniqlash.

Ilova

G-kamroq kasseta usuli transkripsiyaning bazal darajalaridan yuqori bo'lgan promotor kuchini aniqlash uchun ishlatiladi (ya'ni mavjud bo'lganda) transkripsiya faollashtiruvchilari yoki transkripsiya omillari[3]). Masalan, a ta'sirini o'lchash uchun TATA qutisi konsensus ketma-ketligi o'zgartirish Saccharomyces cerevisiae huzurida TFIID, Har bir promouterning nisbiy kuchini o'lchash uchun G-kamroq kassetalar amalga oshirildi.[4]

Afzalliklari

Transkriptsiya darajasini o'lchash uchun G-oz tahlilini dumaloq plazmidda bajarish mumkin. Dairesel plazmid ko'plab tizimlarda oqish transkripsiyasi kabi boshqa tahlillar bilan taqqoslaganda samaraliroq shablonni taqdim etadi, bunda parcha uchi kerak bo'ladi. Ushbu usul radioaktiv yorliqli transkriptlarni juda samarali ishlab chiqaradi, chunki u boshqa bilvosita mRNA mahsulot o'lchovlarini amalga oshirishning keraksiz jarayonini chetlab o'tadi. Promouter G-kamroq kassetani o'z ichiga olgan dumaloq plazmidga kiritiladi, bu plazmid davomida tasodifiy va o'ziga xos bo'lmagan transkripsiyani qoldiradigan ma'lum uzunlikdagi transkriptni hosil qiladi. Ko'pgina xom tizimlar, masalan, HeLa yadro ekstraktlari, ular tarkibida kam miqdordagi ifloslantiruvchi GTP mavjud bo'lib, ular fon transkripsiyasiga olib keladi va vaqti-vaqti bilan tasodifiy transkripsiyani G-kamroq kassetasida o'qishga olib kelishi mumkin.[5]

Adabiyotlar

  1. ^ Park, JH; Magan, N (2014-11-12). "Teskari transkriptaz bilan bog'langan xromatin bilan biriktirilgan p21 promouterida hujayrasiz transkripsiyaning real vaqtda PCR tahlili". PLOS ONE. 6 (8): e23617. doi:10.1371 / journal.pone.0023617. PMC  3160311. PMID  21886803.
  2. ^ Aria Baniahmad (2002). Qalqonsimon bez gormonlari retseptorlari: usullari va protokollari. Springer Science & Business Media. p. 211. ISBN  978-1-59259-174-9.
  3. ^ Kazerouniniya, A; Ngo, B; Martinson, HG (2014-11-12). "Qayta ishlanmagan transkriptlarning poli (A) signaliga bog'liq degradatsiyasi in vitro to'xtatilgan poli (A) signalga bog'liq transkripsiya bilan birga keladi". RNK. 16 (1): 197–210. doi:10.1261 / rna.1622010. PMC  2802029. PMID  19926725.
  4. ^ Byornsdottir, G; Myers, LC (2014-11-12). "RNK polimeraza II transkripsiya apparati minimal komponentlari TATA qutisini konsensusni aniqlaydi". Nuklein kislotalari rez. 36 (9): 2906–16. doi:10.1093 / nar / gkn130. PMC  2396422. PMID  18385157.
  5. ^ Kerey, MF; Peterson, KL; Smale, ST (2014-11-12). "HeLa hujayra yadrosi ekstraktlari yordamida in vitro transkripsiyasi bo'lgan G-kam kasseta". Sovuq bahor harb protokoli. 2010 (3): pdb.prot5387. doi:10.1101 / pdb.prot5387. PMID  20194456.