Virtual koloniya soni - Virtual colony count

Virtual koloniya soni (VCC) kinetik, 96 quduqdir mikrobiologik tahlil qilish dastlab faoliyatini o'lchash uchun ishlab chiqilgan defensinlar.[1] U boshqalarga nisbatan qo'llanilgan mikroblarga qarshi peptidlar shu jumladan LL-37.[2] Bunda bakteriyalar sonini o'sish kinetikasi deb nomlangan sanab chiqish usuli qo'llaniladi, bu bakteriyalar partiyasining kulturasi optik zichlikka erishish uchun ketadigan kalibrlash egri chiziqlari vaqtini taqqoslaydi. VCC nomi hujayra madaniyati infektsiyalari modellarida bakteriyalarni sanab chiqish uchun miqdoriy o'sish kinetikasini qo'llashni tavsiflash uchun ham ishlatilgan.[3]Mikroblarga qarshi sezuvchanlikni tekshirish (AST) 96 quduqli plitalarda suyultirish yo'li bilan amalga oshirilishi mumkin mikroblarga qarshi emlangan bulonda har xil konsentratsiyadagi agent bakteriyalar va o'lchash minimal inhibitor kontsentratsiyasi natijada o'sish bo'lmaydi. Biroq, ushbu usullardan ba'zi membrana-faollarni o'rganish uchun foydalanish mumkin emas mikroblarga qarshi peptidlar, bulyonning o'zi tomonidan inhibe qilinadi. Virtual koloniyalarni hisoblash protsedurasi avval bakterial hujayralarni past tuz tarkibidagi faol mikroblarga qarshi vositaga ta'sir qilish orqali foydalanadi. bufer ikki soat davomida, keyin bir vaqtning o'zida antimikrobiyal faollikni inhibe qiladi va induktsiya qiladi eksponent o'sish bulyon qo'shib. The o'sish kinetikasi Tirik qolgan hujayralarni keyinchalik haroratni boshqarish yordamida nazorat qilish mumkin plastinka o'quvchi.

Miqdoriy o'sish kinetikasi

VCC kalibrlash egri chiziqlari

Sanab chiqish usuli[4] VCC tomonidan ishlatiladigan omon qolgan hujayralar miqdoriy o'sish kinetikasi (QGK) deb nomlanadi. Bu uchun olingan kinetik vaqt bilan bog'liq loyqalik bakteriyalar partiyasining mikrobiologik madaniyat 96 quduq qudug'ida mikroplaka loyqalanishning chegara farqiga kalibrlash o'sishining egri chizig'ining 10 barobar suyultirish seriyasiga erishish.

Hayotiy hujayralar sonini aniqlash, miqdoriy bilan matematik jihatdan o'xshash jarayon yordamida amalga oshiriladi real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (QPCR), QGK tashqari hujayralar, PCR mahsulotlarining nusxalari o'rniga, shiddat bilan o'sib boradi. Eshikka erishish uchun sarflangan vaqt "pol vaqt" deb nomlanadi, Tt, ga teng bo'lgan QPCR qiymati "tsikl vaqti" yoki Ct.

VCC tahlillarida chegara vaqtlarining kechikishiga olib keladigan kamida beshta jarayon mavjud:

1. Yopishqoqlik, bu hujayralarni mikroplakchaga yopishishiga va ehtimol hosil bo'lishiga olib keladi biofilmlar. Ushbu hujayralar to'g'ridan-to'g'ri yorug'lik yo'lida bo'lmaguncha, ularning o'sishi optik zichlik ko'rsatkichlariga ta'sir qilmaydi.

2. Uyg'unlik, hujayralarni birma-bir to'xtatib turadigan hujayralar o'rniga har xil kattalikdagi to'plamlarga to'planishiga olib keladi. ikkilik bo'linish. Birlashish T ning noaniqligi va tebranishini keltirib chiqarishi mumkint. Yopishqoq birikmalar ham yopishqoq bo'lishi mumkin, bu esa hamjihatlik va noaniqlik tufayli ikkala noaniqlikka olib keladi (T ortishit) yopishqoqlik tufayli.

3. Bakteriostatik faollik, bu hujayralarni o'ldirilmasa ham eksponent o'sishga kira olmasligiga olib keladi. Vaqtinchalik bakteriostatik faollik ortib borishi mumkin T, ortib borishit.

4. ning metabolik kechikish bosqichi bakteriyalar o'sishi. Bunday kechikish fazasi tahlilda sodir bo'lishi kutilmoqda edi, chunki tuzlari past bo'lgan tamponda antimikrobiyal peptidlarga dastlabki ta'sir qilish paytida hujayralar sekin o'sadi yoki umuman o'smaydi, ikki marta kontsentratsiyalangan boy muhit qo'shilganda eksponent o'sishga o'tadi. Agar bu metabolik kechikish fazasi antimikrobiyal peptid ishtirokida ko'payib ketsa, uni yuqoridagi 3-toifadagi vaqtinchalik bakteriostatik faollikning bir shakli deb hisoblash mumkin, ammo vaqtincha bakteriostatik faollikning boshqa manbalari, masalan, ta'mirlash uchun zarur bo'lgan vaqt tufayli kechikish. kabi buzilgan hujayra tuzilmalarining hujayra devorlari yoki hujayra membranalari, mumkin.

5. Bakteritsid faoliyat yoki o'ldirish. Kamroq tirik qolgan hujayralar T ning kechikishiga olib keladit chunki tirik qolganlar eksponensial o'sish orqali bir xil miqdordagi loyqalik hosil qilish uchun ko'proq vaqt sarflashadi. Agar Tning ko'payishiga olib keladigan boshqa barcha jarayonlar bo'lsat ahamiyatsiz, VCC tekshiruvi bakteritsid tahliliga aylanadi va Tt QGK tomonidan hayotiy bakteriyalarni sanab chiqish uchun ishlatilishi mumkin. Ushbu soddalashtirilgan holatda VCC "virtual omon qolish" natijalari an'anaviy koloniyalarni bakteritsid tahlilining "omon qolish" natijalariga tengdir.

Bakteriyalar

VCC dastlab peptidlarning oltita shtammiga qarshi antibakterial faolligini aniqlash uchun ishlatilgan Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus va Enterobakter aerogenlari.[1] Odatda, standart Gram-manfiy va Gram-musbat sifat nazorati shtamm solishtiriladi. Escherichia coli ATCC 25922 va Staphylococcus aureus ATCC 29213 navbati bilan standart gram-manfiy va gram-musbat shtammlari sifatida ishlatilgan. VCC ham qo'llanilgan Bacillus antrasis, ning qo'zg'atuvchisi kuydirgi.[5]

Antimikrobiyal peptidlar

Dastlabki virtual koloniya sonini o'rganish oltita odamning faolligini o'lchadi alfa defensinlari bir vaqtning o'zida o'sha 96 quduqli plastinkada: HNP1, HNP2, HNP3, HNP4, HD5 va HD6.[1] Keyinchalik, mutatsiyaga uchragan VCC tomonidan ushbu oltita defensinning bir nechtasining shakllari o'rganilgan. Konservalangan glitsin a beta shishishi HNP2 da bir qator bilan almashtirildi D-aminokislotalar natijada VCC faolligi yon zanjirga mutanosib hidrofobiklik va zaryadlash.[6] VCC shuni ko'rsatdiki, N-terminalli atsetillangan va / yoki C-terminalli amnitatsiyalangan HNP2 faolligi mutanosib elektrostatik zaryadlash.[7] VCC natijalari yana tuz ko'prigini buzadigan mutantlar uchun to'lov uchun mutanosib bo'lib, HNP2 funktsiyasi uchun tuz ko'prigi kerak emasligini ko'rsatdi.[8] VCC ning N-terminal tabiiy va sun'iy pro segmentlarining ahamiyati o'lchandi propeptid HNP1, faoliyatni keskin o'zgartiradi Escherichia coli va Staphylococcus aureus.[9][10] Enantiomer HNP1, HNP4, HD5 va beta defensin HBD2 to'liq D-aminokislotalardan iborat bo'lib, defensin ta'sirining turli mexanizmlarini taklif qildi Gram-musbat va Gram-manfiy bakteriyalar.[11] HNP1 ning dimerizatsiyasi buzilgan monomer va bog'langan dimer shakllarining VCC natijalari dimerizatsiya.[12] Konservalangan glitsinni L- ga almashtirishalanin VCC-ning nozik farqlariga olib keldi.[13] Keng qamrovli alaninni skanerlash mutagenez HNP1[14][15] va HD5[16] yirik gidrofob qoldiqlarining ahamiyatini namoyish etdi. Ushbu tadqiqotlar yaqinda kengaytirilib, qo'shimcha qo'shildi beta defensinlar, teta defensinlari,[5] va inson katelitsidini LL-37 va tegishli peptidlar.[2]

Xavfsiz va samarali pipetka texnikasi

VCC foydalanuvchilari yuqorida ko'rsatilgan QGK kalibrlash egri chiziqlariga va dastlabki VCC nashrida keltirilgan kalibrlash egri chiziqlariga o'xshash 90 mikrolitr kabi katta hajm ostidagi 10 mikrolitr kabi hujayralarni kichik hajmda ko'chirishlari kerakligi haqida ogohlantiriladi.[1] ammo xuddi shu qog'ozda defensin faolligini sinash uchun ishlatiladigan eksperimental protseduradan farqli o'laroq. Yaxshilangan pipetka texnikasi 2011 yilda bioxavfsizlik 3-daraja (BSL-3) patogen Bacillus antrasis.[5] 2005 yilda nashr etilgan dastlabki usul 50 mikrolitrlik hujayra suspenziyalarini 50 mikrolitrli suyuqlikka o'tkazishni o'z ichiga oladi, bu esa ko'pik, pufakchalar va loyqalanish hosil qiladi, bu hujayralar to'g'ridan-to'g'ri fosfat tampon ostidagi quduqlarning tubiga o'tkazilganda turbidimetrik usul bilan mos kelmaydi. echimlar. Yuqoridagi tomchilar paydo bo'lishi mumkinligi sababli, hujayra suspenziyalarini qo'shish orqali ushbu muammodan qochish kerak aerozollar bu o'zaro ifloslanishni keltirib chiqaradi.[17] Bioaerozollar Xavfli bakteriyalar, shuningdek, xatarlarni keltirib chiqarishi mumkin, bular ichida tajribalar o'tkazish orqali kamayishi mumkin bioxavfsizlik shkafi.

Adabiyotlar

  1. ^ a b v d Eriksen B, Vu Z, Lu V, Lehrer RI (2005). "Antibakterial faollik va oltita odam a-defensinlari". Mikrobga qarshi. Agentlar Chemother. 49 (1): 269–75. doi:10.1128 / AAC.49.1.269-275.2005. PMC  538877. PMID  15616305.
  2. ^ a b Pazgier M, Eriksen B, Ling M, Toth EA, Shi J, Li X, Gallixer-Bekli A, Lan L, Zou G, Chjan S, Yuan V, Pojarski E, Lu V (2013). "LL-37 inson katelitsidini pro-domenining tarkibiy va funktsional tahlili". Biokimyo. 52 (9): 1547–58. doi:10.1021 / bi301008r. PMC  3634326. PMID  23406372.
  3. ^ Hoffmann S, Valter S, Blume AK, Fuchs S, Shmidt C, Scholz A, Gerlach RG (2018). "Virtual koloniya sonlari yordamida bakteriyalar va hujayralar o'zaro ta'sirining yuqori samaradorligini aniqlash". Old hujayradan yuqadigan mikrobiol. 8 (43). doi:10.3389 / fcimb.2018.00043. PMC  5818393. PMID  29497603.
  4. ^ Brewster, JD. (2003). "Bakteriyalarni sanash uchun oddiy mikro o'sish tahlili". J Mikrobiol usullari. 53 (1): 77–86. doi:10.1016 / S0167-7012 (02) 00226-9. PMID  12609726.
  5. ^ a b v Welkos S, Cote CK, Xahn U, Shastak O, Jedermann J, Bozue J, Jung G, Ruchala P, Pratikhya P, Tang T, Lehrer RI, Beyer V (2011). "Insoniylashtirilgan teta-defensinlar (retrotsiklinlar) makrofagning ishlashini yaxshilaydi va sichqonlarni eksperimental kuydirgi infektsiyasidan himoya qiladi". Mikrobga qarshi. Agentlar Chemother. 55 (9): 4238–50. doi:10.1128 / AAC.00267-11. PMC  3165295. PMID  21768520.
  6. ^ Xie C, Praxl A, Eriksen B, Vu Z, Zeng P, Li X, Lu VY, Lubkovski J, Lu V (2005). "D-aminokislotalar yordamida sutemizuvchilarning defensinlarida saqlanib qolgan beta-bo'rtiqni qayta tiklash". J Biol Chem. 280 (38): 32921–9. doi:10.1074 / jbc.M503084200. PMID  15894545.
  7. ^ Xie C, Zeng P, Ericksen B, Wu Z, Lu WY, Lu V (2005). "Inson neytrofil alfa-defensin 2-dagi terminal zaryadlarning bakteritsid va membrana faolligiga ta'siri". Peptidlar. 26 (12): 2377–83. doi:10.1016 / j.peptidlar.2005.06.002. PMID  16009464.
  8. ^ Vu Z, Li X, de Liu E, Eriksen B, Lu V (2005). "Nima uchun Arg5-Glu13 tuz ko'prigi sutemizuvchilarning alfa-defensinlarida saqlanib qolgan?". J Biol Chem. 280 (52): 43039–47. doi:10.1074 / jbc.M510562200. PMID  16246847.
  9. ^ Vu Z, Li X, Eriksen B, de Liu E, Zou G, Zeng P, Xie S, Li C, Lubkovski J, Lu VY, Lu V (2007). "Pro-segmentlarning inson neytrofil alfa-defensinlari katlamasi va ishlashiga ta'siri". J Mol Biol. 368 (2): 537–49. doi:10.1016 / j.jmb.2007.02.040. PMC  2754399. PMID  17355880.
  10. ^ Zou G, de Leeuw E, Lubkovski J, Lu V (2008). "Inson neytrofil alfa defensin 1 va uning propeptidi bilan o'zaro ta'sirining molekulyar determinantlari". J Mol Biol. 381 (5): 1281–91. doi:10.1016 / j.jmb.2008.06.066. PMC  2754386. PMID  18616948.
  11. ^ Vey G, de Liu E, Pazgier M, Yuan V, Zou G, Vang J, Eriksen B, Lu VY, Lehrer RI, Lu V (2009). "Ko'rinadigan shisha orqali odamning enantiomerik defensinlaridan mexanik tushunchalar". J Biol Chem. 284 (42): 29180–92. doi:10.1074 / jbc.M109.018085. PMC  2781462. PMID  19640840.
  12. ^ Pazgier M, Vey G, Eriksen B, Jung G, Vu Z, de Liu E, Yuan V, Szmacinski H, Lu VY, Lubkovskiy J, Lehrer RI, Lu V (2012). "Ba'zan tangoga ikki narsa kerak bo'ladi: dimerizatsiyaning inson a-defensin HNP1 peptidi funktsiyalariga qo'shgan hissasi". J Biol Chem. 287 (12): 8944–53. doi:10.1074 / jbc.M111.332205. PMC  3308808. PMID  22270360.
  13. ^ Zhao L, Eriksen B, Vu X, Chjan S, Yuan V, Li X, Pazgier M, Lu V (2012). "Gli o'zgarmas qoldig'i a-defensinni katlama, dimerizatsiya va funktsiyasi uchun muhimdir: inson neytrofil a-defensin HNP1 ning holatini o'rganish". J Biol Chem. 287 (23): 18900–12. doi:10.1074 / jbc.M112.355255. PMC  3365925. PMID  22496447.
  14. ^ Vey G, Pazgier M, de Liu E, Rajabi M, Li J, Zou G, Jung G, Yuan V, Lu VY, Lehrer RI, Lu V (2010). "Trp-26 inson alfa-defensin HNP1 ga funktsional ko'p qirralilik beradi". J Biol Chem. 285 (21): 16275–85. doi:10.1074 / jbc.M110.102749. PMC  2871495. PMID  20220136.
  15. ^ Zhao L, Tolbert VD, Eriksen B, Chjan S, Vu X, Yuan V, Li X, Pazgier M, Lu V (2013). "Oligomerik interfeyslarda bitta, ikki va to'rt kishilik Alanin almashtirishlari inson neytrofili Alpha Defensin HNP1 funktsiyasini hal qiluvchi omil sifatida gidrofobiklikni aniqlaydi". PLOS ONE. 8 (11): e78937. doi:10.1371 / journal.pone.0078937. PMC  3827289. PMID  24236072.
  16. ^ Rajabi M, Eriksen B, Vu X, de Liu E, Zhao L, Pazgier M, Lu V (2012). "Inson ichagi a-defensin HD5 ning funktsional determinantlari: dimer interfeysida gidrofobiklik uchun hal qiluvchi rol". J Biol Chem. 287 (26): 21615–27. doi:10.1074 / jbc.M112.367995. PMC  3381126. PMID  22573326.
  17. ^ Eriksen B (2014). "Aerozollardan saqlanish uchun yopishqoq va yopishqoq Escherichia coli hujayralarini mikroplakalarga o'tkazish usullarining xavfsizligi, samaradorligi va foydaliligi". F1000Res. 3: 267. doi:10.12688 / f1000 qidiruv.5659.2. PMC  4309163. PMID  25671086.

Tashqi havolalar