Haqiqiy vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi - Real-time polymerase chain reaction

Teskari transkripsiya polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR) uchun qarang teskari transkripsiya polimeraza zanjiri reaktsiyasi.
SYBR Yashil real vaqtda PCRda ishlab chiqarilgan lyuminestsentsiya jadvali
Eritma egri chizig'i real vaqtda PCR oxirida hosil bo'ldi

A real vaqtda polimeraza zanjiri reaktsiyasi (real vaqtda PCR), shuningdek, nomi bilan tanilgan miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qPCR), a laboratoriya texnikasi ning molekulyar biologiya asosida polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR). Maqsadni kuchaytirishni nazorat qiladi DNK an'anaviy PCR-da bo'lgani kabi, uning oxirida emas, balki PCR paytida (ya'ni, real vaqtda) molekula. Haqiqiy vaqtdagi PCR miqdoriy (real vaqtda PCR) va yarim miqdoriy (ya'ni ma'lum miqdordagi DNK molekulalarining yuqorisida / ostida) (yarim miqdoriy real vaqtda PCR) ishlatilishi mumkin.

PCR mahsulotlarini real vaqtda PCRda aniqlashning ikkita keng tarqalgan usuli (1) o'ziga xos bo'lmagan lyuminestsent bo'yoqlar bu interkalate har qanday ikki zanjirli DNK bilan va (2) ketma-ketlikka xos DNK zondlari iborat oligonukleotidlar a bilan belgilangan lyuminestsent muxbir, bu faqat keyin aniqlashga imkon beradi duragaylash uning izchilligini to'ldiruvchi zond.

The Haqiqiy vaqt bo'yicha PCR tajribalarini nashr etish uchun minimal ma'lumot (MIQE) ko'rsatmalarida qisqartirish taklif etiladi qPCR miqdoriy real vaqtda PCR uchun ishlatilishi mumkin RT-qPCR teskari transkripsiya uchun foydalanish mumkin - qPCR.[1] "RT-PCR" qisqartmasi odatda bildiradi teskari transkripsiya polimeraza zanjiri reaktsiyasi va real vaqtda PCR emas, balki barcha mualliflar ushbu konventsiyaga rioya qilmaydilar.[2]

Fon

Haqiqiy vaqtda PCR foydalanadi floroforlar darajalarini aniqlash uchun gen ekspressioni.

Barcha organizmlardagi hujayralar tartibga solinadi gen ekspressioni gen transkriptlarining aylanmasi bo'yicha (bitta torli) RNK ): Hujayrada ekspres qilingan gen miqdori namunadagi ushbu genning RNK transkriptining nusxalari soni bilan o'lchanishi mumkin. Kam miqdordagi RNKdan gen ekspressionini aniq aniqlash va miqdorini aniqlash uchun gen transkripsiyasini kuchaytirish zarur. The polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) DNKni kuchaytirishning keng tarqalgan usuli; RNK asosidagi PCR uchun RNK namunasi birinchi navbatda teskari transkripsiya qilinadi bir-birini to'ldiruvchi DNK (cDNA) bilan teskari transkriptaz.

Kichik miqdordagi DNKni kuchaytirish uchun DNK shablonidan foydalangan holda an'anaviy PCR-da bo'lgani kabi metodologiyadan foydalaniladi, kamida bitta juftlik astarlar, deoksiribonukleotidlar, mos buferli eritma va termostabil DNK polimeraza. Bilan belgilangan modda florofor a tarkibida ushbu aralashga qo'shiladi termal velosiped o'z ichiga oladi sensorlar o'lchash uchun lyuminestsentsiya zarur bo'lganda hayajonlangandan keyin floroforning to'lqin uzunligi ishlab chiqarish tezligini bir yoki bir nechta aniq mahsulotlar uchun o'lchashga imkon berish. Bu har bir PCR tsiklida kuchaytirilgan mahsulotni ishlab chiqarish tezligini o'lchashga imkon beradi. Shunday qilib yaratilgan ma'lumotlarni hisoblash uchun kompyuter dasturlari yordamida tahlil qilish mumkin nisbiy gen ekspressioni (yoki mRNA nusxasi) bir nechta namunalarda. Miqdor PCR, shuningdek, ushbu namunalarda ma'lum bir DNK ketma-ketligi borligini va ko'pligini aniqlash uchun namunalardagi DNKni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun ham qo'llanilishi mumkin.[3] Ushbu o'lchov har bir amplifikatsiya davridan keyin amalga oshiriladi va shuning uchun bu usul real vaqtda PCR (ya'ni darhol yoki bir vaqtning o'zida PCR) deb nomlanadi. RNK miqdorini aniqlashda shablon quyidagicha bo'ladi bir-birini to'ldiruvchi DNK (cDNA), tomonidan olinadi teskari transkripsiya ning ribonuklein kislotasi (RNK). Bunday holda RT-PCR yoki Q-RT-PCR miqdoriy uslubi qo'llaniladi.

Miqdor PCR va DNK mikroarray o'rganish uchun zamonaviy metodikalar gen ekspressioni. MRNA ko'pligini o'lchash uchun eski usullardan foydalanilgan: Differentsial displey, RNazni himoya qilish tahlili va shimoliy blot. Shimoliy blotting ko'pincha namunadagi mRNA transkriptining ko'pligini tasavvur qilib, genning ekspression darajasini baholash uchun ishlatiladi. Ushbu usulda tozalangan RNK tomonidan ajratiladi agarozli gel elektroforez, qattiq matritsaga (masalan, neylon membrana) o'tkaziladi va o'ziga xos xususiyat bilan tekshiriladi DNK yoki RNK zond anavi bir-birini to'ldiruvchi qiziqish geniga. Ushbu uslub hali ham gen ekspressionini baholash uchun ishlatilgan bo'lsa-da, u nisbatan katta miqdordagi RNKni talab qiladi va mRNA darajalarining faqat sifatli yoki yarim miqdoriy ma'lumotlarini beradi.[4] Miqdorni aniqlash usulidagi o'zgarishlardan kelib chiqadigan taxminiy xatolar DNK yaxlitligining natijasi bo'lishi mumkin, ferment samaradorligi va boshqa ko'plab omillar. Shu sababli bir qator standartlashtirish tizimlar (ko'pincha deyiladi normalizatsiya usullari ) ishlab chiqilgan. Ba'zilari umumiy gen ekspressionini miqdoriy aniqlash uchun ishlab chiqilgan, ammo eng keng tarqalgani deyarli doimiy ekspression darajasi uchun tanlangan, normalizatsiya qiluvchi gen deb nomlangan boshqa genga nisbatan o'rganilayotgan o'ziga xos genni miqdoriy aniqlashga qaratilgan. Ushbu genlar ko'pincha tanlanadi uyni saqlash genlari ularning funktsiyalari asosiy bilan bog'liq uyali omon qolish odatda shuni anglatadi konstitutsiyaviy gen ekspressioni.[5][6] Bu tadqiqotchilarga qiziqish genlarini ifodalash uchun tanlangan normallashtiruvchi bilan ifodalangan bo'linish nisbati to'g'risida hisobot berishga imkon beradi va shu bilan avvalgi ekspressionning mutlaq darajasini bilmasdan taqqoslashga imkon beradi.

Quyidagi molekulalarni kodlashda eng ko'p ishlatiladigan normalizatsiya qiluvchi genlar: tubulin, glitseraldegid-3-fosfat dehidrogenaza, albumin, siklofilin va ribosoma RNKlari.[4]

Asosiy tamoyillar

Asosiy maqola: Polimeraza zanjiri reaktsiyasi

Haqiqiy vaqtda PCR a-da amalga oshiriladi termal velosiped har bir namunani kamida bitta belgilangan to'lqin uzunlikdagi yorug'lik nurlari bilan yoritadigan va hayajonlanganlar tomonidan chiqarilgan lyuminestsentsiyani aniqlaydigan quvvatga ega florofor. Termal tsiklator shuningdek namunalarni tez isitadi va sovitadi va shu bilan fizik-kimyoviy xususiyatlaridan foydalanadi nuklein kislotalar va DNK polimeraza.

PCR jarayoni odatda 25-50 marta takrorlanadigan bir qator harorat o'zgarishlaridan iborat. Ushbu tsikllar odatda uch bosqichdan iborat: birinchisi, 95 ° C atrofida, nuklein kislotasining juft zanjirini ajratishga imkon beradi; ikkinchisi, taxminan 50-60 ° C haroratda, primerlarni DNK shablon bilan bog'lashga imkon beradi;[7] uchinchisi, 68-72 ° S gacha bo'lgan haroratni osonlashtiradi polimerizatsiya DNK polimeraza tomonidan amalga oshiriladi. Parchalarning kichikligi sababli, bu turdagi PCR-da oxirgi bosqich odatda qoldiriladi, chunki ferment hizalanish bosqichi va denatura bosqichi o'rtasidagi o'zgarish paytida ularning sonini ko'paytirishi mumkin. Bundan tashqari, to'rt bosqichli PCRda lyuminestsentsiya har bir tsikldagi atigi bir necha soniya davom etadigan qisqa haroratli fazalarda, masalan, harorati 80 ° C bo'lgan primer dimerlarning mavjudligini kamaytirish uchun o'lchanadi. o'ziga xos bo'lmagan bo'yoq ishlatilganda.[8] Har bir tsikl uchun ishlatiladigan harorat va vaqt turli xil parametrlarga bog'liq, masalan: DNKni sintez qilish uchun ishlatiladigan ferment, ikki valentli ionlarning kontsentratsiyasi va deoksiribonukleotidlar (dNTPs) reaktsiyasida va primerlarning bog'lanish haroratida.[9]h

Kimyoviy tasnif

Haqiqiy vaqtda PCR texnikasi PCR mahsulotini, o'ziga xos yoki o'ziga xos bo'lmagan floroxromlarni aniqlash uchun ishlatiladigan kimyo bo'yicha tasniflanishi mumkin.

Maxsus bo'lmagan aniqlash: reportyorlar sifatida ikki tomonlama DNK bilan bog'lovchi bo'yoqlar bilan real vaqtda PCR

DNK bilan bog'lovchi bo'yoq barcha ikki zanjirli (ds) bilan bog'lanadi DNK PCR-da, bo'yoqning lyuminestsent kvant rentabelligini oshirish. PCR paytida DNK mahsulotining ko'payishi har bir siklda o'lchanadigan lyuminestsentsiya intensivligining oshishiga olib keladi. Biroq, kabi dsDNA bo'yoqlari SYBR Yashil barcha dsDNA PCR mahsulotlariga, shu jumladan o'ziga xos bo'lmagan PCR mahsulotlariga (masalan,) ulanadi Primer dimer ). Bu maqsadli ketma-ketlikni aniq nazorat qilishga xalaqit berishi yoki oldini olishi mumkin.

DsDNA bo'yoqlari bilan real vaqtda PCRda reaksiya odatdagidek tayyorlanadi, unga lyuminestsent dsDNA bo'yoq qo'shiladi. Keyin reaksiya a real vaqtda PCR vositasi va har bir tsikldan keyin flüoresans intensivligi detektor yordamida o'lchanadi; bo'yoq faqat dsDNA (ya'ni PCR mahsuloti) bilan bog'langanda floresanlashadi. Ushbu usul faqat kuchaytirishni amalga oshirish uchun bir juft primerga ehtiyoj sezadigan afzalliklarga ega, bu esa xarajatlarni kamaytiradi; turli xil bo'yoqlardan foydalangan holda naychada bir nechta maqsadli ketma-ketlikni kuzatish mumkin.

Maxsus aniqlash: lyuminestsent muxbirni tekshirish usuli

(1) Buzilmagan problarda muxbirning lyuminestsentsiyasi o'chadi. (2) Zondlar va bir-birini to'ldiruvchi DNK zanjiri duragaylangan va muxbirlar lyuminestsentsiyasi hali ham o'chirilgan. (3) PCR paytida prob Taq polimeraza va parchalanadigan lyuminestsent muxbir tomonidan parchalanadi.

Floresan muxbir zondlari faqat zondni to'ldiruvchi ketma-ketlikni o'z ichiga olgan DNKni aniqlaydi; shuning uchun reportyor zondidan foydalanish o'ziga xoslikni sezilarli darajada oshiradi va boshqa dsDNA mavjud bo'lganda ham texnikani bajarishga imkon beradi. Turli xil rangli yorliqlardan foydalangan holda, lyuminestsent probalar bir xil naychadagi bir nechta maqsadli ketma-ketlikni kuzatish uchun multipleksli tahlillarda ishlatilishi mumkin. Flüoresan reportyor zondlarining o'ziga xosligi, shuningdek, o'lchovlarning aralashuvini oldini oladi primer dimerlari, bu PCR-da istalmagan potentsial yon mahsulotlar. Shu bilan birga, lyuminestsent muxbir zondlari primer dimerlarning inhibitiv ta'siriga to'sqinlik qilmaydi, bu esa kerakli mahsulotlarning reaktsiyasida to'planishini susaytirishi mumkin.

Usul DNK asosidagi zondga asoslangan va uning uchida lyuminestsent muxbir mavjud söndürücü zondning qarama-qarshi uchida joylashgan lyuminestsentsiya. Reporterning so'ndiruvchiga yaqinligi uning lyuminestsentsiyasini aniqlashning oldini oladi; zondning 5 'dan 3' gacha buzilishi ekzonukleaz faoliyati Taq polimeraza reportyor-söndürücü yaqinligini buzadi va shu bilan keyin aniqlanishi mumkin bo'lgan söndürülmemiş lyuminestsentsiya emissiyasini beradi. hayajon lazer yordamida. Har bir PCR tsiklida reportyor zondiga yo'naltirilgan mahsulotning ko'payishi, shu sababli probning buzilishi va muxbirning chiqarilishi tufayli floresansning mutanosib o'sishiga olib keladi.

  1. PCR odatdagidek tayyorlanadi (qarang) PCR ) va muxbir tekshiruvi qo'shiladi.
  2. Reaksiya boshlanganda, davomida tavlash PCR bosqichi ham prob, ham primerlar DNK nishoniga bog'langan.
  3. Yangi DNK zanjirining polimerizatsiyasi primerlardan boshlanadi va polimeraza zondga etib borgach, uning 5'-3'-ekzonuklezi zondni parchalaydi va lyuminestsent muxbirni söndürücüden fizik ravishda ajratadi, natijada lyuminestsentsiya ko'payadi.
  4. Fluoresans real vaqtda PCR apparatida aniqlanadi va o'lchanadi va uning mahsulotning eksponent darajasiga ko'payishiga mos keladigan geometrik o'sishi miqdoriy tsiklni aniqlash uchun ishlatiladi (Cq) har bir reaktsiyada.

Füzyon harorati tahlili

Bir qator PCR mahsulotlari uchun alohida sintez egri chiziqlari (aniq ranglarni ko'rsatuvchi). Kuchayish reaktsiyalarini ma'lum bir mahsulot (pushti, ko'k) va boshqa salbiy natija (yashil, to'q sariq) uchun ko'rish mumkin. O'q bilan ko'rsatilgan termoyadroviy cho'qqisi kutilgan kuchaytiruvchi mahsulotdan farqli o'laroq, primer dimerlari keltirib chiqaradigan eng yuqori ko'rsatkichni ko'rsatadi.[10]

Haqiqiy vaqtda PCR o'ziga xos, kuchaytirilgan DNK fragmentlarini ularning tahlillari yordamida aniqlashga imkon beradi erish harorati (shuningdek, deyiladi Tm qiymati, m danchayqalish timperatorlik). Odatda foydalanilgan usul, reportyor sifatida DNKni bog'laydigan ikki ipli bo'yoqlari bo'lgan PCR va ishlatiladigan bo'yoq odatda SYBR Green. DNKning erish harorati kuchaytirilgan fragmentga xosdir. Ushbu texnikaning natijalari tahlil qilingan DNK namunalarining dissotsilanish egri chiziqlarini taqqoslash yo'li bilan olinadi.[11]

An'anaviy PCR-dan farqli o'laroq, ushbu usul oldingi foydalanishdan qochadi elektroforez barcha namunalarning natijalarini namoyish qilish texnikasi. Buning sababi shundaki, kinetik usul bo'lishiga qaramay, miqdoriy PCR odatda aniq yakuniy nuqtada baholanadi. Shuning uchun texnik odatda tezkor natijalarni beradi va / yoki elektroforezga qaraganda kamroq reaktivlardan foydalanadi. Agar keyingi elektroforez zarur bo'lsa, faqat real vaqtda PCR shubhali ekanligini ko'rsatgan namunalarni sinab ko'rish va / yoki ma'lum bir determinant uchun ijobiy sinovdan o'tgan namunalar uchun natijalarni tasdiqlash kerak.

Modellashtirish

PCR-ning so'nggi nuqtasidan (an'anaviy PCR) farqli o'laroq, real vaqtda PCR amplifikatsiya jarayonining istalgan nuqtasida kerakli mahsulotni lyuminestsentsiyani o'lchash orqali kuzatishga imkon beradi (real vaqt rejimida o'lchov uning chegarasi bo'yicha berilgan chegarada amalga oshiriladi). Haqiqiy vaqtda PCR yordamida DNK miqdorini aniqlashning keng qo'llaniladigan usuli floresansni a tsikllar soniga qarab tuzishga bog'liq. logaritmik o'lchov. DNK asosidagi lyuminestsentsiyani aniqlash uchun chegara 3-5 martaga o'rnatiladi standart og'ish fondan yuqoridagi signal shovqini. Floresans chegaradan oshib ketadigan tsikllar soni pol chegarasi (C) deb nomlanadit) yoki MIQE ko'rsatmalariga muvofiq, miqdoriy tsikl (Cq).[12]

Eksponentli amplifikatsiya bosqichida maqsadli DNK shablonining (amplikon) miqdori har bir tsiklni ikki baravar oshiradi. Masalan, DNK namunasi, uning Cq boshqa namunadagi namunadan oldin 3 tsiklda 2 mavjud3 = 8 marta ko'proq shablon. Biroq, amplifikatsiya samaradorligi ko'pincha primerlar va shablonlar orasida o'zgaruvchan. Shuning uchun primer-shablon kombinatsiyasining samaradorligi a-da baholanadi titrlash a yaratish uchun DNK shablonini ketma-ket suyultirish bilan tajriba standart egri ning o'zgarishi (Cq) har bir suyultirish bilan. The Nishab ning chiziqli regressiya keyin amplifikatsiya samaradorligini aniqlash uchun ishlatiladi, agar 1: 2 gacha suyultirish natijasida a hosil bo'lsa, 100% bo'ladi (Cq) 1. tsikl chegarasi usuli reaktsiya mexanizmining bir nechta taxminlarini keltirib chiqaradi va ma'lumotni tahlil qilish paytida sezilarli farqni keltirib chiqarishi mumkin bo'lgan kuchaytiruvchi profilning past signalli-shovqinli hududlaridan olingan ma'lumotlarga bog'liq.[13]

Gen ekspressionini miqdorini aniqlash uchun (Cq) chunki qiziqish genidan RNK yoki DNK ayiriladi (Cq) turli xil namunalar orasidagi RNK miqdori va sifatining o'zgarishini normallashtirish uchun bir xil namunadagi uy xo'jaligi genidan RNK / DNK. Ushbu normalizatsiya protsedurasi odatda ΔCt- usul[14] va turli xil namunalar orasida qiziqish genining ifodasini taqqoslashga imkon beradi. Biroq, bunday taqqoslash uchun normallashtiruvchi mos yozuvlar genining ifodasi barcha namunalar bo'yicha juda o'xshash bo'lishi kerak. Ushbu mezonga mos keladigan mos yozuvlar genini tanlash juda muhim va ko'pincha qiyin, chunki juda kam sonli genlar turli xil sharoitlarda yoki to'qimalarda bir xil darajada ekspressionni namoyish etadi.[15][16] Tsikl chegaralarini tahlil qilish ko'plab tijorat dasturiy ta'minot tizimlari bilan birlashtirilgan bo'lsa-da, takroriy takrorlash xavfi tug'diradigan holatlarda ko'rib chiqilishi kerak bo'lgan amplifikatsiya profilini tahlil qilishning aniqroq va ishonchli usullari mavjud.[13]

Mexanizmga asoslangan qPCR miqdorini aniqlash usullari ham taklif qilingan va ularning afzalliklari shundaki, ular miqdoriy aniqlash uchun standart egri chiziqni talab qilmaydi. MAK2 kabi usullar[17] standart egri usullariga teng yoki yaxshiroq miqdoriy ko'rsatkichlarga ega ekanligi ko'rsatilgan. Mexanizmga asoslangan ushbu usullar dastlabki namunadagi konsentratsiyani baholash uchun polimerazni kuchaytirish jarayoni haqidagi bilimlardan foydalanadi. Ushbu yondashuvning kengaytirilishi butun PCR reaksiya profilining aniq modelini o'z ichiga oladi, bu signaldan shovqinga qadar yuqori ma'lumotlardan foydalanish va tahlildan oldin ma'lumotlar sifatini tasdiqlash imkoniyatini beradi.[13]

Ruijter va boshqalarning tadqiqotlariga ko'ra.[18] MAK2 PCR reaktsiyasi paytida doimiy ravishda kuchaytirish samaradorligini oladi. Shu bilan birga, MAK2 olingan polimeraza zanjiri reaktsiyasining nazariy tahlili, PCR davomida amplifikatsiya samaradorligi doimiy emasligini aniqladi. MAK2 miqdorini aniqlash normal qPCR sharoitida namunadagi DNKning maqsadli kontsentratsiyasini ishonchli baholashni ta'minlagan bo'lsa, MAK2 qPCR tahlillari uchun maqsadli kontsentratsiyani raqobatchilar bilan ishonchli tarzda aniqlay olmaydi.

Ilovalar

Kantitativ polimeraza zanjiri reaktsiyasi uchun ko'plab dasturlar mavjud laboratoriya. Odatda ikkalasi uchun ham qo'llaniladi diagnostik va asosiy tadqiqotlar. Texnikaning sanoatda qo'llanilishiga oziq-ovqat mahsulotlarida yoki o'simlik moddalarida mikrobial yuk miqdorini aniqlash, GMOlarni aniqlash kiradi (Genetik jihatdan o'zgartirilgan organizmlar ) va odam virusli patogenlarining miqdorini aniqlash va genotiplash.

Gen ekspressionining miqdori

An'anaviy DNKni aniqlash usullari bilan genlarning ekspresyonini aniqlash ishonchsizdir. Aniqlash mRNA a shimoliy blot yoki PCR mahsulotlari a jel yoki Janubiy blot aniq miqdorni aniqlashga imkon bermaydi.[19] Masalan, odatdagi PCR ning 20-40 tsikli davomida DNK mahsuloti miqdori a ga etadi plato bu boshlang'ich PCRdagi maqsadli DNK miqdori bilan bevosita bog'liq emas.[20]

Haqiqiy vaqtda PCR yordamida miqdorni aniqlash mumkin nuklein kislotalar ikkita umumiy usul bilan: nisbiy miqdor va absolyut miqdor.[21] Mutlaq miqdoriy miqdor DNK molekulalarining aniq sonini a yordamida DNK standartlari bilan taqqoslab beradi kalibrlash egri chizig'i. Shuning uchun namunadagi PCR va standart bir xil bo'lishi juda muhimdir kuchaytirish samaradorligi.[22]Nisbatan kantifikatsiya maqsadli gen ekspressionidagi katlama-farqlarni aniqlash uchun ichki mos yozuvlar genlariga asoslangan. Kantifikatsiya mRNK ekspression darajalarining o'zgarishi sifatida izohlanadi bir-birini to'ldiruvchi DNK (cDNA, tomonidan yaratilgan teskari transkripsiya mRNK). Nisbiy miqdorni aniqlash osonroq, chunki u kalibrlash egri chizig'ini talab qilmaydi, chunki o'rganilayotgan gen miqdori nazorat mos yozuvlar genining miqdori bilan taqqoslanadi.

Nisbiy miqdoriy natijalarni ifodalash uchun ishlatiladigan birliklar ahamiyatsiz bo'lganligi sababli, natijalarni turli xil RTqPCR bo'yicha taqqoslash mumkin. Bir yoki bir nechta uyni saqlash genlaridan foydalanishning sababi, teskari transkripsiya samaradorligiga va shu sababli butun PCR jarayoniga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan RNK miqdori va sifatidagi farqlar kabi o'ziga xos bo'lmagan o'zgarishni to'g'rilashdir. Biroq, jarayonning eng muhim jihati shundaki, mos yozuvlar geni barqaror bo'lishi kerak.[23]

Ushbu ma'lumotnoma genlarini tanlash an'anaviy ravishda amalga oshirildi molekulyar biologiya sifatli yoki yarim miqdoriy tadqiqotlar yordamida, masalan, RNK gellarini vizual tekshirish, shimoliy blot densitometriya yoki yarim miqdoriy PCR (PCR taqlid qilish). Endi, ichida genom Ko'pgina organizmlar uchun batafsilroq taxminlarni amalga oshirish mumkin transkriptomik texnologiyalar.[24] Shu bilan birga, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, mRNK ekspressionini miqdoriy aniqlashda foydalaniladigan mos yozuvlar genlarining ko'pchiligini kuchaytirish tajriba sharoitlariga qarab o'zgarib turadi.[25][26][27] Shuning uchun boshlang'ichni bajarish kerak statistik jihatdan eng mos mos yozuvlar genini tanlash uchun ovozli uslubiy o'rganish.

Bir qator statistik algoritmlar ishlab chiqilgan bo'lib, ular qaysi gen yoki genlarni berilgan sharoitda foydalanish uchun eng mos ekanligini aniqlashi mumkin. GeNORM yoki BestKeeper singari juftlarni solishtirishlari mumkin geometrik vositalar turli xil mos yozuvlar genlari matritsasi uchun va to'qimalar.[28][29]

Diagnostik foydalanish

Diagnostik sifatli PCR tezkor aniqlash uchun qo'llaniladi nuklein kislotalar diagnostikasi, masalan, yuqumli kasalliklar, saraton va genetik anormalliklar. Sifatli PCR tahlillarini joriy etish klinik mikrobiologiya laboratoriyasi yuqumli kasalliklar diagnostikasini sezilarli darajada yaxshilagan,[30] va yangi paydo bo'lgan kasalliklarni, masalan, yangi shtammlarni aniqlash vositasi sifatida joylashtirilgan gripp va koronavirus,[31] yilda diagnostika testlari.[32][33]

Mikrobiologik foydalanish

Miqdorli PCR shuningdek oziq-ovqat xavfsizligi, oziq-ovqat mahsulotlarining buzilishi va fermentatsiyasi sohalarida va suv sifatining (ichimlik va rekreatsion suvlarning) mikrobial xavfini baholashda va aholining sog'lig'ini muhofaza qilishda ishlaydigan mikrobiologlar tomonidan qo'llaniladi.[34]

qPCR atrof-muhit namunalaridan olingan DNKdagi genlarning taksonomik yoki funktsional belgilarini kuchaytirish uchun ham ishlatilishi mumkin.[35] Markerlar DNK yoki qo'shimcha DNKning genetik qismlari bilan ifodalanadi.[35] Muayyan gentik elementni kuchaytirish orqali amplifikatsiyadan oldin namunadagi element miqdorini aniqlash mumkin.[35] Taksonomik markerlardan (ribosomal genlar) va qPCR dan foydalanish namunadagi mikroorganizmlar miqdorini aniqlashga yordam beradi va markerning o'ziga xos xususiyatiga qarab turli xil oilalarni, nasllarni yoki turlarni aniqlashi mumkin.[35] Funktsional markerlardan (oqsillarni kodlovchi genlardan) foydalanish atrofdagi muhit haqida ma'lumotni ochib bera oladigan jamoada gen ekspressionini namoyish qilishi mumkin.[35]

Fitopatogenlarni aniqlash

Qishloq xo'jaligi sanoati iqtisodiy yo'qotishlarning oldini olish va sog'lig'ini saqlash maqsadida kasallik qo'zg'atuvchisiz o'simlik tarqalishi yoki ko'chatlarini ishlab chiqarishga doimo intilmoqda. DNKning oz miqdorini aniqlashga imkon beradigan tizimlar ishlab chiqilgan Phytophthora ramorum, o'ldiradigan oomitset Emanlar va mezbon o'simlikning DNK bilan aralashtirilgan boshqa turlari. Qo'zg'atuvchining DNKsi va o'simlik o'rtasidagi diskriminatsiya ITS ketma-ketligini kuchaytirishga asoslangan, ajratgichlar ribosomal RNK har bir takson uchun xarakterli bo'lgan genlarning kodlash maydoni.[36] Xuddi shu patogenni aniqlash uchun ushbu texnikaning dalaga asoslangan versiyalari ham ishlab chiqilgan.[37]

Genetik jihatdan o'zgartirilgan organizmlarni aniqlash

Teskari transkripsiyadan foydalangan holda qPCR (RT-qPCR) aniqlash uchun ishlatilishi mumkin GMO DNKni aniqlashda uning sezgirligi va dinamik diapazonini hisobga olgan holda. DNK yoki oqsil tahlili kabi alternativalar odatda kam sezgir. Transgenni emas, balki kuchaytiradigan maxsus primerlardan foydalaniladi targ'ibotchi, terminator yoki vektorni muhandislik qilish jarayonida ishlatiladigan oraliq ketma-ketliklar. Transgenik o'simlikni yaratish jarayoni odatda transgenning bir nechta nusxasini kiritilishiga olib keladi, chunki uning miqdori ham odatda baholanadi. Bu ko'pincha ishlov berilgan turlardan faqat bitta nusxada mavjud bo'lgan nazorat geni yordamida nisbiy miqdoriy aniqlash orqali amalga oshiriladi.[38][39]

Klinik miqdoriy aniqlash va genotiplash

Viruslar odamda to'g'ridan-to'g'ri infektsiya yoki qo'shma infektsiyalar tufayli mavjud bo'lishi mumkin tashxis klassik usullardan foydalanish qiyin va natijada noto'g'ri bo'lishi mumkin prognoz va davolash. QPCR dan foydalanish, masalan, virusni miqdorini aniqlashga va genotiplashga (eritma egri chiziqlari yordamida bajariladigan shtammni tavsiflashga) imkon beradi. Gepatit B virusi.[40] Bemorning to'qima birligiga virusli genomning nusxalari sifatida aniqlangan infektsiya darajasi ko'p hollarda dolzarbdir; masalan, 1-turdagi ehtimollik oddiy herpes virusi qayta faollashishi yuqtirganlarning soni bilan bog'liq neyronlar ichida ganglionlar.[41] Ushbu miqdor teskari transkripsiya bilan yoki unsiz amalga oshiriladi, chunki virus tsiklning istalgan nuqtasida inson genomiga qo'shilsa, masalan HPV (inson papillomavirusi), bu erda uning ba'zi variantlari paydo bo'lishi bilan bog'liq bachadon bo'yni saratoni.[42]

Adabiyotlar

  1. ^ Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Xuggett J, Kubista M, Myuller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). "MIQE ko'rsatmalari: real vaqtda PCR tajribalarini nashr etish uchun minimal ma'lumot". Klinik kimyo. 55 (4): 611–622. doi:10.1373 / clinchem.2008.112797. PMID  19246619.
  2. ^ Logan, Juli; Edvards, Kirstin va Sonders, Nik, nashr. (2009). Haqiqiy vaqtda PCR: dolzarb texnologiyalar va dasturlar. Caister Academic Press. ISBN  978-1-904455-39-4.
  3. ^ Vatson, J D; Beyker, T A; Bell, S P; Gann, A; Levin, M; Losick, R (2004). Genning molekulyar biologiyasi (Beshinchi nashr). San-Frantsisko: Benjamin Kammings. ISBN  978-0-321-22368-5.
  4. ^ a b Maykl V. Pfaff, Ales Tichopad, Christian Prgomet va Tanja P. Neuvians (2005). Uyni saqlash bo'yicha barqaror genlarni, differentsial tartibga solinadigan maqsadli genlarni va namunalarning yaxlitligini aniqlash: BestKeeper - juftlik bo'yicha korrelyatsiyalar yordamida Excelga asoslangan vosita Biotexnologiya xatlari 26:509–515
  5. ^ Pfaffl, MVt; Xorgan, GV; Dempfle, L (2002). "Nisbatan ifoda dasturiy vositasi (REST ©) guruhli oqilona taqqoslash va real vaqtda PCR natijalarini nisbiy ifodalash natijalarini statistik tahlil qilish uchun". Nuklein kislotalari rez. 30 (9): e36. doi:10.1093 / nar / 30.9.e36. PMC  113859. PMID  11972351.
  6. ^ Vandesompele, J; De Preter, K; Pattin, F; Poppe, B; Van Roy, N; De Paepe, A; Speleman, F (2002). "Ko'p sonli ichki nazorat genlarini geometrik o'rtacha hisoblash yo'li bilan real vaqtda RT-PCR miqdoriy ma'lumotlarini aniq normallashtirish". Genom biologiyasi. 3 (7): 1–12. doi:10.1186 / gb-2002-3-7-tadqiqot0034. PMC  126239. PMID  12184808.
  7. ^ Rychlik V, Spenser VJ, Rhoads RE (1990). "DNKni kuchaytirish uchun tavlanish haroratini optimallashtirish in vitro". Nuklein kislotalari rez. 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093 / nar / 18.21.6409. PMC  332522. PMID  2243783.
  8. ^ Pfaffl, Maykl (2000). "LightCycler SYBR Green I texnologiyasidan foydalangan holda tashqi standartlashtirilgan miqdoriy insulinga o'xshash o'sish omil-1 RT-PCRni ishlab chiqish va tasdiqlash" (PDF). Biokimyo (3) - gene-quantification.org orqali.
  9. ^ Jozef Sambruk va Devid V. Rassel (2001). Molekulyar klonlash: laboratoriya qo'llanmasi (3-nashr). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratoriya matbuoti. ISBN  978-0-87969-576-7.
  10. ^ Ponchel F; Tlar S; Bransfild K; Leong F.T; Duglas S.H; S.L maydoni; Bell S.M; Combaret V; Puisieux A; Migel A.J (2003). "SYBR-Green I lyuminestsentsiyasiga asoslangan real vaqtda PCR: genlarni qayta tashkil etish, genlarni kuchaytirish va mikro genlarni yo'q qilish nisbiy miqdorini aniqlash uchun TaqMan tahliliga alternativa". BMC Biotexnol. 3: 18. doi:10.1186/1472-6750-3-18. PMC  270040. PMID  14552656.
  11. ^ Riri K.M; Rasmussen R.P; Wittwer C.T. (1997). "Polimeraza zanjiri reaktsiyasi paytida DNKning erishi egri chiziqlarini tahlil qilish orqali mahsulotning differentsiatsiyasi" (PDF). Analitik biokimyo. 245 (2): 154–160. doi:10.1006 / abio.1996.9916. PMID  9056205.
  12. ^ Stiven A. Bustin; Vladimir Benes; Jeremi A. Garson; Jan Hellemans; Jim Xugget; Mikael Kubista; Reyxold Myuller; Tania Nolan; Maykl V.Pfaffl; Gregori L. Shipley; Jo Vandesompele va Karl T. Wittwer (2009 yil aprel). "MIQE bo'yicha ko'rsatmalar: PCR bo'yicha real vaqt tajribalarini nashr etish uchun minimal ma'lumot". Klinika. Kimyoviy. 55 (4): 611–622. doi:10.1373 / clinchem.2008.112797. PMID  19246619.
  13. ^ a b v Karr, A. S .; Mur, S. D. (2012). Lucia, Alejandro (tahrir). "Global fitting yordamida polimeraza zanjiri reaktsiyalarining mustahkam miqdori". PLOS ONE. 7 (5): e37640. Bibcode:2012PLoSO ... 737640C. doi:10.1371 / journal.pone.0037640. PMC  3365123. PMID  22701526.
  14. ^ Schefe JH, Lehmann KE, Buschmann IR, Unger T, Funke-Kaiser H (2006). "Miqdoriy real vaqtda RT-PCR ma'lumotlarini tahlil qilish: dolzarb tushunchalar va yangi" gen ekspressionining KT farqi "formulasi". J Mol Med. 84 (11): 901–910. doi:10.1007 / s00109-006-0097-6. PMID  16972087.
  15. ^ Nailis H, Coenye T, Van Nieuerburg F, Deforce D, Nelis HJ (2006). "Candida albicans biofilmlarida genlarni ekspressiyasini o'rganish uchun turli xil normallashtirish strategiyasini ishlab chiqish va real vaqtda PCR yordamida baholash". BMC mol. Biol. 7 (1): 25. doi:10.1186/1471-2199-7-25. PMC  1557526. PMID  16889665.
  16. ^ Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). "Haqiqiy vaqtda RT-PCR yordamida mRNA miqdorini aniqlash". Nat. Protokol. 1 (3): 1559–1582. doi:10.1038 / nprot.2006.236. PMID  17406449.
  17. ^ Boggy G, Vulf PJ (2010). Ravasi T (tahrir). "PCR ma'lumotlarining miqdoriy miqdorini aniq aniqlash uchun PCR mexanik modeli". PLOS ONE. 5 (8): e12355. Bibcode:2010PLoSO ... 512355B. doi:10.1371 / journal.pone.0012355. PMC  2930010. PMID  20814578.
  18. ^ Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, Derveaux S, Hellemans J, Vandesompele J (2012). "Ishonchli biomarkerni aniqlash uchun qPCR egri chizig'ini tahlil qilish usullarini baholash: noto'g'ri, aniqlik, aniqlik va natijalar". Usullari. 59 (1): 32–46. doi:10.1016 / j.ymeth.2012.08.011. PMID  22975077.
  19. ^ Bryus Gelerter. "Kornea kasalliklarini davolash uchun PEMF". lemuriatechnologies.com. Arxivlandi asl nusxasi 2014-06-09.
  20. ^ Overberg, L .; Giulietti, A .; Valkx, D.; Decallonne, R .; Bouilon, R .; Mathieu, C. (2003). "Sitokin genining ekspression miqdorini aniqlash uchun real vaqtda teskari transkriptaz PCR dan foydalanish". Biomolekulyar texnika jurnali: JBT. 14 (1): 33–43. PMC  2279895. PMID  12901609.
  21. ^ S. Dhanasekaran; T. Mark Doxerti; Jon Kennet; TB sinovlarini o'rganish guruhi (2010 yil mart). "Haqiqiy vaqtda PCR asosidagi absolyut miqdorni aniqlash uchun turli xil standartlarni taqqoslash". Immunologik usullar jurnali. 354 (1–2): 34–39. doi:10.1016 / j.jim.2010.01.004. PMID  20109462.
  22. ^ Bar, Tszachi; Kubista, Mikael; Tichopad, Ales (2011-10-19). "QPCR-da kinetik o'xshashlikni tasdiqlash". Nuklein kislotalarni tadqiq qilish. 40 (4): 1395–1406. doi:10.1093 / nar / gkr778. ISSN  0305-1048. PMC  3287174. PMID  22013160.
  23. ^ Brunner, AM; Yakovlev, IA; Strauss, SH (2004). "O'simliklar genlarining ekspression eksperimentini o'rganish bo'yicha ichki nazoratni tekshirish". BMC zavodi Biol. 4: 14. doi:10.1186/1471-2229-4-14. PMC  515301. PMID  15317655. Arxivlandi asl nusxasi 2013-08-02 da.
  24. ^ McGettigan, Pol A (2013). "RNK-seq davrida transkriptomikalar". Kimyoviy biologiyaning hozirgi fikri. 17 (1): 4–11. doi:10.1016 / j.cbpa.2012.12.008. PMID  23290152.
  25. ^ Thellin, O; Zorzi, V; Lakaye, B; De Borman, B; Kumanlar, B; Xenne, G; Grisar, T; Igout, A; Heinen, E (1999). "Uyni saqlash genlari ichki standartlar sifatida: foydalanish va chegaralar". J Biotexnol. 75 (2–3): 197–200. doi:10.1016 / s0168-1656 (99) 00163-7. PMID  10617337.
  26. ^ Radonik, A; Thulke, S; Makey, IM; Landt, O; Zigert, Vt; Nitsche, A (2004). "Haqiqiy vaqtda PCR uchun miqdoriy genlarni tanlash bo'yicha qo'llanma". Biokimyo Biofiz Res Commun. 313 (4): 856–862. doi:10.1016 / j.bbrc.2003.11.177. PMID  14706621. Arxivlandi asl nusxasi 2013-08-02 da.
  27. ^ Dxeda, K; Xugget, JF; Bustin, SA; Jonson, MA; Rook, G; Zumla, A (2004). "Haqiqiy vaqtda PCRda RNK ekspressionini normallashtirish uchun uy xo'jaligi genlarini tasdiqlash". Biotexnikalar. 37 (1): 112–119. doi:10.2144 / 04371RR03. PMID  15283208.
  28. ^ Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002) bir nechta ichki nazorat genlarining geometrik o'rtacha hisobidan real vaqtda miqdoriy RT-PCR ma'lumotlarini aniq normallashtirish " Genom Biol 37: TADQIQOT 0034
  29. ^ Pfaffl, MVt; Tichopad, A; Prgomet, C; Neuvians, TP (2004). "Uyni saqlash bo'yicha barqaror genlarni, differentsial tartibga solinadigan maqsadli genlarni va namunalarning yaxlitligini aniqlash: BestKeeper - juftlik bo'yicha korrelyatsiya yordamida Excelga asoslangan vosita". Biotexnol Lett. 26 (6): 509–515. doi:10.1023 / b: safro.0000019559.84305.47. PMID  15127793. Arxivlandi asl nusxasi 2013-08-02 da.
  30. ^ Espy, MJ (2006 yil yanvar). "Klinik mikrobiologiyada real vaqtda PCR: muntazam laboratoriya sinovlari uchun arizalar". Klinik mikrobiologiya sharhlari. 19 (3): 165–256. doi:10.1128 / CMR.19.1.165-256.2006. PMC  1360278. PMID  16418529.
  31. ^ Dhamad, AE; Abdal Rhida, MA (2020). "COVID-19: molekulyar va serologik aniqlash usullari". PeerJ. 8: e10180. doi:10.7717 / peerj.10180. PMID  33083156.
  32. ^ "FDA tomonidan tozalangan RT-PCR tahlillari va gripp viruslari uchun boshqa molekulyar tahlillar" (PDF). cdc.gov.
  33. ^ "rRT-PCR, Wuhan koronavirus holatini tasdiqlash usuli - kimyo uchun sun'iy aql". Olingan 2020-01-26.
  34. ^ Filion, M, tahrir. (2012). Amaliy mikrobiologiyada kantitativ real vaqtda PCR. Caister Academic Press. ISBN  978-1-908230-01-0.
  35. ^ a b v d e Bouchez, Blieux, Dequiedt, Domaizon, Dyufresne, Ferreira, Godon, Hellal, Joulian, Quaiser, Martin-Lorent, Mauffret, Monier, Peyret, Shmitt-Koplin, Sibourg, Doiron, Bispo, Deportes, Grand, Kuni, Maron, Ranjard (sentyabr 2016). "Atrof muhit diagnostikasi uchun molekulyar mikrobiologiya usullari". Atrof-muhit kimyosi xatlari. 14 (4): 423–441. doi:10.1007 / s10311-016-0581-3. Olingan 11 may 2020.CS1 maint: bir nechta ism: mualliflar ro'yxati (havola)
  36. ^ Bolduin, B.G. (1992). "O'simliklardagi yadro ribosomal DNKning ichki transkripsiya qilingan ajratgichlarining filogenetik foydaliligi: Kompozitogiyadan misol". Molekulyar filogenetik va evolyutsiyasi. 1 (1): 3–16. doi:10.1016 / 1055-7903 (92) 90030-K. PMID  1342921.
  37. ^ Tomlinson, J. A .; Barker, I .; Boonham, N. (2007). "Phytophthora ramorumni dalada yaxshilangan molekulyar aniqlashning tezroq, sodda va o'ziga xos usullari". Amaliy va atrof-muhit mikrobiologiyasi. 73 (12): 4040–4047. doi:10.1128 / AEM.00161-07. PMC  1932743. PMID  17449689.
  38. ^ Xolst-Jensen, Arne; Ronning, Sissel B.; Lyveset, Astrid; Berdal, Knut G. (2003). "Genetik modifikatsiyalangan organizmlarni (GMO) tekshirish va miqdorini aniqlash uchun PCR texnologiyasi". Analitik va bioanalitik kimyo. 375 (8): 985–993. doi:10.1007 / s00216-003-1767-7. PMID  12733008.
  39. ^ Brodmann P.D; Ilg E.C; Berthoud H; Herrmann A. (2002). "... Genetika jihatidan modifikatsiyalangan to'rtta makkajo'xori navlari uchun vaqt miqdoriy polimeraza zanjiri reaktsiyasi usullari ...". AOAC International jurnali. 85 (3): 646–653. doi:10.1093 / jaoac / 85.3.646. PMID  12083257.
  40. ^ Yeh S.H. Tsay C.Y. Kao J.H. Liu SJ Kuo T.J. Lin MW Huang W.L. Lu S.F. Jih J. Chen D.S. Boshqalar (2004). "Gepatit B virusini real vaqtda PCR va eritish orqali yagona reaktsiyada miqdoriy aniqlash va genotiplash ...". Gepatologiya jurnali. 41 (4): 659–666. doi:10.1016 / j.jhep.2004.06.031. PMID  15464248.
  41. ^ Sawtell N.M. (1998). "Herpes Simplex Virusining 1-turi in Vivo jonli ravishda qayta tiklanish ehtimoli Gangliyadagi yashirin yuqtirilgan neyronlar sonining ko'payishi bilan". Virusologiya jurnali. 72 (8): 6888–6892. doi:10.1128 / JVI.72.8.6888-6892.1998. PMC  109900. PMID  9658140.
  42. ^ Piter M. Rosti C. Kutyure J. Radvanyi F. Teshima H. ​​Sastre-garau X. (2006). "Genital o'smalardagi MYC lokalizatsiyasida HPV DNKning birikishi bilan bog'liq bo'lgan MYC faollashuvi". Onkogen. 25 (44): 5985–5993. doi:10.1038 / sj.onc.1209625. PMID  16682952.

Bibliografiya