Hajmi-chiqarib tashlanadigan xromatografiya - Size-exclusion chromatography

Hajmi-chiqarib tashlanadigan xromatografiya
Size exclusion.jpg
Istisno xromatografiyasini o'tkazish uchun uskunalar. Tampon ustun orqali (o'ngda) kompyuter tomonidan boshqariladigan moslama orqali pompalanadi
QisqartmaSEC
TasnifiXromatografiya
Analitiklarmakromolekulalar
sintetik polimerlar
biomolekulalar
Ishlab chiqaruvchilarCytiva, Bio-Works, Bio-Rad, Knauer, emp Biotech
Boshqa usullar
Bog'liqYuqori mahsuldor suyuq kromatografiya
Suvli normal fazali xromatografiya
Ion almashinadigan xromatografiya
Misel suyuq kromatografiyasi

Hajmi-chiqarib tashlanadigan xromatografiya (SEC), shuningdek, nomi bilan tanilgan molekulyar elak xromatografiyasi,[1] a xromatografik eritmadagi molekulalarni kattaligi bilan ajratish usuli va ba'zi hollarda molekulyar og'irlik.[2] Odatda katta uchun qo'llaniladi molekulalar yoki oqsillar va sanoat polimerlari kabi makromolekulyar komplekslar. Odatda, namunani kolonnadan olib o'tish uchun suvli eritma ishlatilganda, texnika quyidagicha tanilgan gel-filtratsiya xromatografiyasi, ismga nisbatan gel o'tkazuvchanligi xromatografiyasi, bu organik erituvchi mobil faza sifatida ishlatilganda ishlatiladi. Xromatografiya ustuni dekstran polimerlari (Sephadex), agaroza (Separoza) yoki poliakrilamid (Sepakril yoki BioGel P) dan tashkil topgan mayda, g'ovakli boncuklar bilan o'ralgan. Ushbu boncukların teshik o'lchamlari makromolekulalarning o'lchamlarini taxmin qilish uchun ishlatiladi.[1] SEC keng tarqalgan polimerlarni tavsiflash Yaxshilikni ta'minlash qobiliyati tufayli usul molyar massa taqsimoti (Mw) natijalar polimerlar uchun.

Ilovalar

Jel-filtratsiya xromatografiyasining asosiy qo'llanilishi fraktsiya oqsillarni va boshqa suvda eruvchan polimerlarni, gel bilan xromatografiya esa organik eruvchan polimerlarning molekulyar og'irlik taqsimotini tahlil qilish uchun ishlatiladi. Har qanday texnikani aralashtirmaslik kerak gel elektroforezi, bu erda elektr maydon molekulalarni elektr zaryadlariga qarab jel orqali "tortish" yoki "surish" uchun ishlatiladi. Teshik ichida erigan moddaning qolish vaqti teshik o'lchamiga bog'liq. Kattaroq eritmalar kichik hajmga ega bo'ladi va aksincha. Shuning uchun kichikroq eritilgan eritma kattaroq eritma bilan taqqoslaganda uzoqroq vaqt davomida teshik ichida qoladi.[3]

O'lchamni istisno qilish xromatografiyasining yana bir usuli suvdagi tabiiy organik moddalarning barqarorligi va xususiyatlarini o'rganishdir.[4] Ushbu uslubda Margit B. Myuller, Daniel Shmitt va Fritz X. Frimmel ma'lum vaqt davomida tabiiy organik moddalarning qanchalik barqarorligini aniqlash uchun dunyoning turli joylaridan suv manbalarini sinab ko'rishdi.[4] Tabiiy organik materiallarni o'rganish uchun o'lchovni istisno qilish xromatografiyasidan keng foydalanilsa ham, cheklovlar mavjud. Ushbu cheklovlardan biri standart molekulyar og'irlik belgisi yo'qligini o'z ichiga oladi;[4] natijada natijalarni taqqoslash uchun hech narsa yo'q. Agar aniq molekulyar og'irlik zarur bo'lsa, boshqa usullardan foydalanish kerak.

Afzalliklari

Ushbu usulning afzalliklari orasida katta molekulalarni kichik molekulalardan minimal miqdordagi eluat bilan yaxshi ajratish,[5] va filtrlash jarayoniga aralashmasdan turli xil eritmalarni qo'llash mumkin, bularning barchasi zarralarning ajralishi uchun biologik faolligini saqlab qoladi. Ushbu texnik odatda molekulalarni kislotalilik, asoslilik, zaryad va ba'zi birikmalarga yaqinligi kabi boshqa xususiyatlar bo'yicha ajratib turadigan boshqalar bilan birlashtiriladi. O'lchamni chiqarib tashlash xromatografiyasi bilan yaxshi sezgirlikka olib keladigan qisqa va aniq belgilangan ajratish vaqtlari va tor bantlar mavjud. Namunaning yo'qolishi ham yo'q, chunki eruvchan moddalar statsionar faza bilan o'zaro ta'sir qilmaydi.

Ushbu eksperimental usulning boshqa afzalligi shundaki, ba'zi hollarda aralashmaning taxminiy molekulyar og'irligini aniqlash mumkin. Murakkabning shakli va o'lchamlari (elluent) birikmaning jel bilan qanday ta'sir qilishini aniqlaydi (statsionar faza). Taxminan molekulyar og'irlikni aniqlash uchun ularga mos keladigan molekulyar og'irliklarga ega bo'lgan birikmalarning elüsyon hajmlari olinadi va keyin "Kav"Vs" log (Mw) "qaerda amalga oshiriladi va Mw - molekulyar massa. Ushbu uchastka kerakli birikmaning molekulyar og'irligini taxmin qilish uchun ishlatiladigan kalibrlash egri chizig'i vazifasini bajaradi. Ve komponent - bu oraliq molekulalar elontsiya qilinadigan hajmni, masalan, ustun boncuklarına qisman kirish imkoniyatiga ega bo'lgan molekulalarni aks ettiradi. Bundan tashqari, Vt boncuklar orasidagi umumiy hajm va boncuklar ichidagi hajmning yig'indisi. Vo tarkibiy qism boshida elute bo'lgan katta molekulalar elute bo'lgan hajmni ifodalaydi.[6][7] Kamchiliklari, masalan, faqat cheklangan miqdordagi tasmalarni joylashtirish mumkin, chunki xromatogrammaning vaqt shkalasi qisqa va umuman olganda, yaxshi piksellar sonini olish uchun molekulyar massada 10% farq bo'lishi kerak.[5]

Kashfiyot

Ushbu uslub 1955 yilda London qirolichasi Sharlotta kasalxonasida ishlaydigan Grant Genri Torna va Kolin R Rutven tomonidan ixtiro qilingan.[8][9] Keyinchalik ular ushbu ixtiro uchun Jon Skot mukofotiga sazovor bo'lishdi.[10] Torna va Rutven matritsa sifatida kraxmalli jellardan foydalangan bo'lsa, Jerker Porath va Per Flodin keyinchalik dekstran jellari joriy etildi;[11] fraksiya xususiyatiga ega bo'lgan boshqa jellarga agaroza va poliakrilamid kiradi. Ushbu o'zgarishlarning qisqacha sharhi paydo bo'ldi.[12]

Sintetik yuqori polimerlarni fraktsiyalashga urinishlar ham bo'lgan; ammo, faqat 1964 yilgacha, J. C. Mur Dow Chemical Company tayyorlash bo'yicha o'z ishini nashr etdi gel o'tkazuvchanligi xromatografiyasi (GPC) ustunlar o'zaro bog'liq polistirol nazorat ostidagi gözenek hajmi bilan,[13] ushbu sohadagi tadqiqot faoliyatining tez sur'atlarda o'sishi boshlandi. Tegishli kalibrlash bilan GPC molyar massani va qodirligini deyarli darhol angladilar molyar massa taqsimoti sintetik polimerlar uchun ma'lumot. Oxirgi ma'lumotni boshqa usullar bilan olish qiyin bo'lganligi sababli, GPC tezkorlik bilan keng qo'llanila boshlandi.[14]

Nazariya va uslub

Agaroza AKTA-da oqsillarni tozalash uchun ishlatiladigan asosli SEC ustunlari FPLC mashina.

SEC asosan oqsillar yoki polimerlar kabi yirik molekulalarni tahlil qilish uchun ishlatiladi. SEC kichikroq molekulalarni teshikchalariga tushirish orqali ishlaydi adsorban ("statsionar faza"). Ushbu jarayon odatda ustun ichida amalga oshiriladi, bu odatda har xil o'lchamdagi teshiklarni o'z ichiga olgan mikron miqyosli polimer boncuklar bilan mahkam o'ralgan ichi bo'sh trubadan iborat. Ushbu teshiklar sirtdagi depressiyalar yoki boncuk orqali o'tadigan kanallar bo'lishi mumkin. Eritma kolonnadan o'tayotganda ba'zi zarralar teshiklarga kiradi. Kattaroq zarralar shuncha teshikka kira olmaydi. Zarralar qanchalik katta bo'lsa, elitatsiya tezroq bo'ladi. Kattaroq molekulalar shunchaki teshiklardan o'tib ketadi, chunki bu molekulalar teshiklarga kirish uchun juda katta. Shuning uchun katta molekulalar ustun orqali kichik molekulalarga qaraganda tezroq oqadi, ya'ni molekula qancha kichik bo'lsa, ushlab turish vaqti shuncha ko'p bo'ladi.

SEC uchun talablardan biri shundaki, analitik statsionar fazalar yuzasi bilan o'zaro ta'sir o'tkazmasligi kerak, chunki analitiklar orasidagi elusiya vaqtidagi farqlar ideal holda faqat statsionar fazalar bilan kimyoviy yoki elektrostatik ta'sir o'tkazish o'rniga, faqat analitiklar kirishi mumkin bo'lgan eritma hajmiga asoslanadi. Shunday qilib, statsionar fazali teshik tizimining har bir mintaqasiga kira oladigan kichik molekula butun teshik hajmi va zarrachalararo hajmining yig'indisiga teng bo'lgan umumiy hajmni kiritishi mumkin. Ushbu kichik molekula kech elitatsiya qilinadi (molekula barcha teshik va zarrachalar hajmiga kirib borgandan so'ng - ustun hajmining taxminan 80%). Boshqa biron bir kichik teshikka kira olmaydigan juda katta molekula faqat zarrachalararo hajmga kira oladi (ustun hajmining ~ 35%) va bu mobil faza kolonnadan o'tganida oldinroq ajralib chiqadi. SECning asosiy printsipi shundaki, har xil o'lchamdagi zarralar elute (filtr) statsionar faza orqali turli stavkalarda. Bu zarrachalarning o'lchamiga asoslangan eritmasini ajratishga olib keladi. Barcha zarrachalar bir vaqtning o'zida yoki deyarli bir vaqtning o'zida yuklanishi sharti bilan, bir xil o'lchamdagi zarralar birgalikda elute qilinishi kerak.

Biroq, makromolekula o'lchamining turli xil o'lchovlari mavjud (masalan, giratsiya radiusi va gidrodinamik radius), SEC nazariyasining asosiy muammosi har xil turdagi molekulalarni ajratib turadigan mos molekulyar kattalik parametrini tanlashdir. Eksperimental ravishda Benoit va uning hamkasblari ellyusiya hajmi va dinamik asosdagi molekulyar kattalik o'rtasidagi mukammal bog'liqlikni topdilar. gidrodinamik hajm, bir nechta turli xil zanjirli arxitektura va kimyoviy kompozitsiyalar uchun.[15] Gidrodinamik hajmga asoslangan kuzatilgan o'zaro bog'liqlik universal SEC kalibrlashining asosi bo'ldi.

Shunga qaramay, SEC ma'lumotlarini talqin qilishda dinamik xususiyatlarga asoslangan hajmdagi gidrodinamik hajmdan foydalanish to'liq tushunilmagan.[16] Buning sababi shundaki, SEC odatda past oqim tezligi sharoitida ishlaydi, bu erda gidrodinamik omil ajralishga kam ta'sir ko'rsatishi kerak. Aslida, ham nazariya, ham kompyuter simulyatsiyasi termodinamik ajratish printsipini o'z ichiga oladi: ajratish jarayoni eruvchan makromolekulalarning ikki faza o'rtasida muvozanat taqsimoti (bo'linishi) bilan belgilanadi: oraliq bo'shliqda joylashgan suyultirilgan quyma eritma fazasi va teshiklar ichidagi yopiq eritma fazalari. ustunli qadoqlash materiali. Ushbu nazariyaga asoslanib, polimerlarni g'ovaklarga bo'linish uchun tegishli o'lchov parametri o'rtacha uzunlik (chiziq bo'yicha o'rtacha maksimal proektsiya) ekanligi ko'rsatilgan.[17] Ushbu masala to'liq hal qilinmagan bo'lsa-da, ehtimol, o'rtacha o'lchov va gidrodinamik hajm bir-biriga juda bog'liqdir.

O'lchamni istisno qilish ustuni.

Har bir o'lchamdagi istisno ustunida ajratilishi mumkin bo'lgan bir qator molekulyar og'irliklar mavjud. Chetlatish chegarasi ustunning "ishchi" diapazonining yuqori qismidagi molekulyar og'irlikni belgilaydi va molekulalar statsionar fazada qolib ketmaslik uchun juda katta. Diapazonning pastki uchi o'tkazuvchanlik chegarasi bilan belgilanadi, bu harakatsiz fazaning barcha teshiklariga kirib boradigan darajada kichik bo'lgan molekulaning molekulyar og'irligini belgilaydi. Ushbu molekulyar massadan pastdagi barcha molekulalar shunchalik kichikki, ular bitta tasma sifatida elute qilinadi.[5]

Oxirida to'plangan filtrlangan eritma sifatida tanilgan ko'tarish. The bo'sh hajm muhitga kirish uchun juda katta bo'lgan har qanday zarrachalarni o'z ichiga oladi va hal qiluvchi hajmi ustun hajmi.

Quyida keng ko'lamli eksklyuziv xromatografiyada gözenekli gel boncuklar uchun ishlatiladigan materiallar keltirilgan [18]

Sr. Yo'qMateriallar

Va savdo nomi

Fraktsiya oralig'i

(Da da molekulyar massa)

1Sephadex G-100 dan 700 gacha
2Sephadex G-251000 dan 5000 gacha
3Sephadex G-501500 dan 30000 gacha
4Sephadex G-753000 dan 70000 gacha
5Sephadex G-1004000 dan 150000 gacha
6Sephadex G-1505000 dan 300000 gacha
7Sephadex G-2005000 dan 800000 gacha
8Bio-gel P-2100 dan 1800 gacha
9Bio-gel P-61000 dan 6000 gacha
10Bio-gel P-603000 dan 60000 gacha
11Bio-gel P-15015000 dan 150000 gacha
12Bio-gel P-30016000 dan 400000 gacha
13Separoz 2B2 x 106 25 x 10 gacha6
14Separoz 4B3 x 105 3 x 10 gacha6
15Sefaroz 6B104 20 x 10 gacha6

Filtrlashga ta'sir qiluvchi omillar

Nazariyani aks ettiruvchi multfilm o'lchovni istisno qilish xromatografiyasi

Haqiqiy hayot sharoitida eritmadagi zarrachalar aniq o'lchamga ega emas, natijada zarrachani uning yonidan o'ng tomondan o'tib ketadigan teshik xalaqit berishi mumkin. Shuningdek, statsionar fazali zarralar ideal tarzda aniqlanmagan; ikkala zarrachalar va teshiklar hajmi jihatidan farq qilishi mumkin. Shuning uchun elution egri chiziqlari o'xshashdir Gauss taqsimoti. Statsionar faza zarracha bilan istalmagan tarzda o'zaro ta'sirlashishi va ushlab turish vaqtiga ta'sir qilishi mumkin, ammo ustun ishlab chiqaruvchilari tomonidan harakatsiz va bu masalani minimallashtirilgan statsionar fazalardan foydalanishga katta e'tibor beriladi.

Xromatografiyaning boshqa shakllari singari, ustun uzunligini oshirish piksellar sonini oshiradi va ustun diametrini oshirish ustunlar hajmini oshiradi. To'g'ri ustunli qadoqlash maksimal aniqlik uchun muhimdir: Haddan tashqari o'ralgan ustun boncuklardagi teshiklarni yiqitishi mumkin, natijada piksellar sonini yo'qotadi. To'ldirilmagan ustun, turg'un fazaning nisbatan kichik sirtini kichikroq turlarga etishishini kamaytirishi mumkin, natijada bu turlar g'ovaklarga tushib qolish uchun kamroq vaqt sarflashadi. Afsuslanish xromatografiya usullaridan farqli o'laroq, ustunning yuqori qismidagi erituvchi bosh o'lchamini keskin pasaytirishi mumkin, chunki namuna yuklanishdan oldin tarqalib, quyi oqim ellyusiyasini kengaytiradi.

Tahlil

Oddiy qo'lda ustunlarda ellyutsiya kasrlar deb nomlanuvchi doimiy hajmlarda yig'iladi. Zarrachalar hajmi jihatidan qanchalik o'xshash bo'lsa, ular bir xil fraktsiyada bo'lishlari va alohida aniqlanmaslik ehtimoli shunchalik katta. Keyinchalik ilg'or ustunlar elitentni doimiy ravishda kuzatib borish orqali ushbu muammoni bartaraf etadi.

O'lchamni istisno qilish ustunini standartlashtirish.

Yig'ilgan fraktsiyalar ko'pincha tekshiriladi spektroskopik usullar ajratilgan zarrachalarning konsentratsiyasini aniqlash uchun. Umumiy spektroskopiyani aniqlash texnikasi sinish ko'rsatkichi (RI) va ultrabinafsha (UV). Spektroskopik jihatdan o'xshash turlarni elitatsiya qilishda (masalan, biologik tozalash paytida), har bir fraksiyon tarkibini aniqlash uchun boshqa usullar zarur bo'lishi mumkin. Shuningdek, eluent oqimini RI bilan doimiy ravishda tahlil qilish mumkin, LOLLAR, Ko'p burchakli lazer nurlarini sochish MALS, UV va / yoki yopishqoqlik o'lchovlari.

SEC xromatogrammasi biologik namuna.

Elüsyon hajmi (Ve) bilan teng ravishda kamayadi logaritma molekulyar gidrodinamik hajm. Ustunlar odatda 4-5 ta standart namunalar (masalan, ma'lum molekulyar og'irlikdagi katlanmış oqsillar) va tiroglobulin kabi juda katta molekulani o'z ichiga olgan namuna yordamida kalibrlanadi. bo'sh hajm. (Moviy dekstran Vo ni aniqlash uchun tavsiya etilmaydi, chunki u heterojen va o'zgaruvchan natija berishi mumkin) Standartlarning ellyusiya hajmi tiroglobulinning (Ve / Vo) ellyusiya hajmiga bo'linadi va standartlarning molekulyar og'irliklari jurnaliga qarshi chizilgan. .

Ilovalar

Biokimyoviy dasturlar

Umuman olganda, SEC past aniqlikdagi xromatografiya deb hisoblanadi, chunki u o'xshash turlarni juda yaxshi farq qilmaydi va shuning uchun ko'pincha tozalashning yakuniy bosqichi uchun ajratiladi. Texnikani aniqlash mumkin to'rtinchi tuzilish almashinish vaqti sekin bo'lgan tozalangan oqsillardan, chunki u tabiiy sharoitda o'tkazilishi mumkin yechim makromolekulyar o'zaro ta'sirni saqlab qolish shartlari. SEC shuningdek, oqsilni tahlil qilishi mumkin uchinchi darajali tuzilish, u gidrodinamik hajmni (molekulyar og'irlikni emas) o'lchab, bir xil oqsilning katlanmış va katlanmagan versiyalarini ajratishga imkon beradi. Masalan, ravshan gidrodinamik radiusi odatdagi oqsil domenining buklangan va katlanmagan shakllari uchun navbati bilan 14 Å va 36 be bo'lishi mumkin. SEC bu ikki shaklni ajratishga imkon beradi, chunki buklangan shakl kichikroq bo'lganligi sababli ancha kech elitatsiya qilinadi.

Polimerlarning sintezi

SEC ham o'lchov, ham o'lchov sifatida ishlatilishi mumkin polidisperslik sintez qilingan polimer, ya'ni polimer molekulalarining o'lchamlarini taqsimlanishini topish qobiliyati. Agar ma'lum o'lchamdagi standartlar ilgari ishlatilgan bo'lsa, unda a kalibrlash egri chizig'i tahlil qilish uchun tanlangan erituvchiga qiziqadigan polimer molekulalarining o'lchamlarini aniqlash uchun yaratilishi mumkin (ko'pincha THF ). Shu bilan bir qatorda, yorug'lik tarqalishi va / yoki kabi usullar viskometriya SEC bilan onlayn ravishda ma'lum molekulyar og'irlik standartlari bilan kalibrlashga ishonmaydigan mutlaq molekulyar og'irliklarni olish uchun foydalanish mumkin. Bir xil molekulyar og'irliklarga ega bo'lgan ikkita polimerning o'lchamlari farqi tufayli, mutlaq aniqlash usullari, umuman olganda, maqbuldir. Odatda SEC tizimi tezda (taxminan yarim soat ichida) polimer kimyogarlarga namunaning kattaligi va polisdispersligi to'g'risida ma'lumot berishi mumkin. Tayyorgarlik SEC uchun foydalanish mumkin polimerlarni fraktsiyalash analitik miqyosda.

Kamchilik

SECda massa polimer molekulalarining gidrodinamik hajmi, ya'ni ma'lum bir polimer molekulasi eritmada bo'lganida qancha joy egallashi bilan o'lchanmaydi. Biroq, taxminiy molekulyar og'irlikni SEC ma'lumotlaridan hisoblash mumkin, chunki polistirol uchun molekulyar og'irlik va gidrodinamik hajm o'rtasidagi aniq bog'liqlikni topish mumkin. Buning uchun polistirol standart sifatida ishlatiladi. Ammo gidrodinamik hajm va molekulyar og'irlik o'rtasidagi bog'liqlik barcha polimerlar uchun bir xil emas, shuning uchun faqat taxminiy o'lchovni olish mumkin.[19]Yana bir kamchilik - bu statsionar faza va analit bilan o'zaro ta'sir o'tkazish imkoniyati. Har qanday o'zaro ta'sir keyinchalik elusiya vaqtiga olib keladi va shu bilan analitikning kichik hajmini taqlid qiladi.

Ushbu usulni amalga oshirayotganda eluting molekulalarning tasmalari kengaytirilishi mumkin. Bu harakatsiz faza molekulalari orqali o'tuvchi mobil faza molekulalarining oqimi natijasida yuzaga keladigan turbulentlik tufayli yuzaga kelishi mumkin. Bundan tashqari, molekulyar termal diffuziya va ishqalanish shisha devorlari molekulalari va eluent molekulalari orasidagi chiziqlar kengayishiga yordam beradi. Kengayishdan tashqari, bantlar bir-biri bilan qoplanadi. Natijada, elim odatda sezilarli darajada suyultiriladi. Guruhlarning kengayish ehtimolini oldini olish uchun bir nechta choralarni ko'rish mumkin. Masalan, namunani ustunning yuqori qismidagi tor, yuqori konsentratsiyalangan lentada qo'llash mumkin. Elyent qancha konsentratsiyalangan bo'lsa, protsedura shunchalik samarali bo'ladi. Shu bilan birga, elimni konsentratsiyalash har doim ham mumkin emas, bu yana bir kamchilik deb hisoblanishi mumkin.[7]

Mutlaq o'lchov-eksklyuziv xromatografiya

Mutlaq o'lchovni istisno qilish xromatografiyasi (ASEC) - bu nur sochadigan asbobni birlashtiruvchi usuldir, odatda ko'p burchakli nurlarning tarqalishi (MALS) yoki boshqa shakli statik nurning tarqalishi (SLS), lekin ehtimol a yorug'likning dinamik ravishda tarqalishi (DLS) vositasi, oqsillar va makromolekulalarning xromatografiya tizimidan ajralib chiqqanda mutloq molyar massasi va / yoki o'lchamlari uchun o'lchovni istisno qiluvchi xromatografiya tizimiga.

Bu holda "mutlaq" ta'rifi shundan iboratki, ko'pincha gidrodinamik diametr (D) deb ataladigan molyar massani yoki gidrodinamik o'lchamlarni olish uchun mos yozuvlar standartlari to'plami bilan ustunda ushlab turish vaqtini kalibrlash talab qilinmaydi.H nm birliklarida). Ideal bo'lmagan ustunli o'zaro ta'sirlar, masalan, ushlab turish vaqtini standartlarga nisbatan modulyatsiya qiladigan elektrostatik yoki gidrofobik sirt ta'sirlari yakuniy natijaga ta'sir qilmaydi. Xuddi shunday, analitik va standart konformatsiyasi o'rtasidagi farqlar mutlaq o'lchovga ta'sir qilmaydi; masalan, MALS tahlili bilan tabiatan tartibsiz bo'lgan oqsillarning molyar massasi bir xil molyar massaga ega bo'lgan globular oqsillarga qaraganda ancha oldinroq elitatsiya qilingan bo'lsa ham, aniq aniqlanadi va xuddi shu narsa chiziqli mos yozuvlar standartlari bilan taqqoslaganda kech elute bo'lgan polimerlarga ham tegishli. bir xil molyar massa bilan[20][21][22]. ASEC-ning yana bir foydasi shundaki, molyar massa va / yoki kattalik elutatsiya cho'qqisining har bir nuqtasida aniqlanadi va shuning uchun tepalik ichidagi bir xillik yoki polisdisperslikni ko'rsatadi. Masalan, monodispers oqsilining SEC-MALS tahlili shuni ko'rsatadiki, butun tepalik bir xil molar massaga ega bo'lgan molekulalardan iborat bo'lib, buni standart SEC tahlili bilan amalga oshirish mumkin emas.

Molyar massani SLS bilan aniqlash uchun yorug'lik tarqalishi o'lchovlarini konsentratsiya o'lchovlari bilan birlashtirish kerak. Shuning uchun SEC-MALS odatda yorug'lik tarqaladigan detektorni va a ni o'z ichiga oladi differentsial refraktometr yoki UV / Vis changni yutish detektori. Bundan tashqari, MALS Rms radiusi R ni aniqlaydig ma'lum bir o'lchov chegarasidan yuqori bo'lgan molekulalar, odatda 10 nm. Shuning uchun SEC-MALS polimerlarning konformatsiyasini molyar massaning R ga bog'liqligi orqali tahlil qilishi mumking. Kichik molekulalar uchun DLS yoki, odatda, gidrodinamik radiusni aniqlash va xuddi shu tarzda molekulyar konformatsiyani baholash uchun differentsial viskometr qo'shiladi.

SEC-DLS-da, makromolekulalarning o'lchamlari o'lchovlarni chiqarib tashlash ustunlari to'plamidan DLS asbobining oqim xujayrasi ichiga elitatsiya qilinganligi sababli o'lchanadi. Molekulalarning yoki zarralarning gidrodinamik kattaligi ularning molekulyar og'irliklari emas, balki o'lchanadi. Oqsillar uchun gidrodinamik kattalikdan molekulyar og'irlikni hisoblash uchun Mark-Xovink hisob-kitob turidan foydalanish mumkin.

SEC bilan birgalikda DLS-ning asosiy afzalligi - kengaytirilgan DLS piksellar sonini olish qobiliyatidir.[23] DLS to'plami tez va sodda va o'rtacha kattalikning to'g'ridan-to'g'ri o'lchovini ta'minlaydi, ammo DLS ning asosiy o'lchamlari diametri 3: 1 nisbatga teng. SEC yordamida oqsillar va oqsil oligomerlari ajratilib, oligomerik rezolyutsiyaga imkon beradi. Aggregatsiya tadqiqotlari ASEC yordamida ham amalga oshirilishi mumkin. Yalpi konsentratsiyani yorug'lik tarqalishi bilan hisoblash mumkin emas (SEC-MALS-da molar massani o'lchash uchun ishlatiladigan onlayn konsentratsion detektor ham agregat kontsentratsiyasini aniqlaydi), agregatning o'lchamini o'lchash mumkin, faqat maksimal o'lchamdagi eluting SEC ustunlaridan.

DLSni aniqlash bilan ASEC ning cheklovlariga oqim tezligi, kontsentratsiya va aniqlik kiradi. Korrelyatsiya funktsiyasi to'g'ri tuzish uchun 3-7 soniyadan ko'proq vaqtni talab qilishi sababli, cheklangan miqdordagi ma'lumotlar nuqtalarini yig'ilish nuqtasida to'plash mumkin. SLSni aniqlash bilan ASEC oqim tezligi bilan chegaralanmaydi va o'lchov vaqti aslida bir zumda bo'ladi va kontsentratsiya diapazoni DLSga qaraganda bir necha daraja kattaroqdir. Biroq, SEC-MALS bilan molyar massani tahlil qilish aniq kontsentratsiyani o'lchashni talab qiladi. MALS va DLS detektorlari ko'pincha SEC tomonidan ajratilgandan so'ng yanada keng qamrovli mutlaq tahlil qilish uchun bitta asbobda birlashtiriladi.

Shuningdek qarang

Adabiyotlar

  1. ^ a b Garret RH, Grisham CM (2013). Biokimyo (5-nashr). Belmont, Kaliforniya: Brooks / Cole, Cengage Learning. p. 108. ISBN  9781133106296. OCLC  1066452448.
  2. ^ Pol-Dofin, S; Karaca, F; Morgan, TJ; va boshq. (6 oktyabr 2007 yil). "Murakkab uglevodorod aralashmalarining zondlash hajmini istisno qilish mexanizmlari: Eluent tarkibini o'zgartirish ta'siri". Energiya va yoqilg'i. 6. 21 (6): 3484–3489. doi:10.1021 / ef700410e.
  3. ^ Bruks DE, Xeyns KA, Xritcu D va boshq. (Iyun 2000). "Hajmni istisno qilish xromatografiyasi teshiklarni talab qilmaydi". Amerika Qo'shma Shtatlari Milliy Fanlar Akademiyasi materiallari. 97 (13): 7064–7. Bibcode:2000PNAS ... 97.7064B. doi:10.1073 / pnas.120129097. JSTOR  122767. PMC  16499. PMID  10852951.
  4. ^ a b v Myuller MB, Shmitt D, Frimmel FH (2000 yil 1-dekabr). "Tabiiy organik moddalarni o'lchamlari bo'yicha xromatografiya bo'yicha fraktsiyalash, fraktsiyalarning xususiyatlari va barqarorligi". Environ Sci Technol. 34 (23): 4867–4872. Bibcode:2000Kirish ... 34.4867M. doi:10.1021 / es000076v.
  5. ^ a b v Skoog DA, Xoller FJ, Crouch SR (2006). "Ch. 28. Suyuq xromatografiya" (PDF). Instrumental tahlil tamoyillari (6-nashr). Belmont, Kaliforniya: Tomson Bruks / Koul. p. 816. ISBN  9780495012016. LCCN  2006926952. OCLC  77224390.
  6. ^ Rouessac A, Rouessac F (2000). Kimyoviy tahlil: zamonaviy instrumental usul va uslublar (Inglizcha tahrir). Chichester: Uili. pp.101 –103. ISBN  978-0471972617. OCLC  635171657.
  7. ^ a b Ballou DP, Benore M, Ninfa AJ (2008). Biokimyo va biotexnologiya uchun asosiy laboratoriya yondashuvlari (2-nashr). Xoboken, NJ: Uili. 127–129 betlar. ISBN  9780470087664.
  8. ^ Torna GH, Rutven CR (avgust 1955). "Kraxmal va suv ustunlaridan foydalangan holda moddalarni molekulyar og'irliklari asosida ajratish". Biokimyoviy jurnal. 60 (4): xxxiv. PMC  1216175. PMID  13249976.
  9. ^ Torna GH, Rutven CR (aprel 1956). "Suvdagi kraxmal ustunlari yordamida moddalarni ajratish va ularning nisbiy molekulyar o'lchamlarini baholash". Biokimyoviy jurnal. 62 (4): 665–74. doi:10.1042 / bj0620665. PMC  1215979. PMID  13315231.
  10. ^ "John Scott mukofotini oluvchilar 1822 yildan - hozirgacha". garfield.library.upenn.edu. Olingan 3-yanvar 2019.
  11. ^ Porat J, Flodin P (1959 yil iyun). "Jelni filtrlash: tuzsizlantirish va guruhni ajratish usuli". Tabiat. 183 (4676): 1657–9. Bibcode:1959 yil natur.183.1657P. doi:10.1038 / 1831657a0. PMID  13666849. S2CID  32287460.
  12. ^ Eyzenshteyn M (2006). "Matritsadagi sarguzashtlar". Tabiat usullari. 3 (5): 410. doi:10.1038 / nmeth0506-410. ISSN  1548-7105. S2CID  37935968.
  13. ^ Mur JC (1964). "Jel o'tkazuvchanlik xromatografiyasi. I. Yuqori polimerlarning molekulyar og'irligini taqsimlashning yangi usuli". J polim ilmiy tadqiqot A.. 2 (2): 835–843. doi:10.1002 / pol.1964.100020220. ISSN  1542-6246.
  14. ^ Striegel A, Yau VW, Kirkland JJ, Bly DD (2009). Zamonaviy o'lchamdagi eksklyuziv suyuqlik xromatografiyasi: Jelni permeatsiya qilish va jelni filtrlash xromatografiyasi (2-nashr). Xoboken, NJ: Uili. ISBN  9780470442876. OCLC  587401945.
  15. ^ Grubisic Z, Rempp P, Benoit H (1967). "Jel o'tkazadigan xromatografiya uchun universal kalibrlash". J polimik ilmiy xodim B. 5 (9): 753–759. Bibcode:1967JPoSL ... 5..753G. doi:10.1002 / pol.1967.110050903. ISSN  1542-6254.
  16. ^ Sun T, Chance RR, Graessli VW, Lohse DJ (2004). "Hajmni istisno qilish xromatografiyasida ajratish printsipini o'rganish". Makromolekulalar. 37 (11): 4304–4312. Bibcode:2004 yil MaMol..37.4304S. doi:10.1021 / ma030586k. ISSN  0024-9297.
  17. ^ Vang Y, Teraoka I, Xansen FY va boshqalar. (2010). "Hajmni istisno qilish xromatografiyasida ajratish printsipini nazariy o'rganish". Makromolekulalar. 43 (3): 1651–1659. Bibcode:2010MaMol..43.1651W. doi:10.1021 / ma902377g. ISSN  0024-9297.
  18. ^ Kumar, Pranav (2018). Biofizika va molekulyar biologiya asoslari va texnikasi. Nyu-Dehli: Pathfinder nashri. p. 05. ISBN  978-93-80473-15-4.
  19. ^ "O'lchamni istisno qilish xromatografiyasi". pslc.ws. Polimer Ilmiy O'quv Markazi (PSLC). 2005 yil. Olingan 3-yanvar 2019.
  20. ^ Uayt, Filip J. (1993 yil 1-fevral). "Yorug'likning tarqalishi va makromolekulalarning mutlaq tavsifi". Analytica Chimica Acta. 272 (1): 1–40. doi:10.1016 / 0003-2670 (93) 80373-S.
  21. ^ Podzimek, Stepan (2014 yil 5-aprel). "Sintetik va tabiiy polimerlarning molyar massa taqsimotini o'lchamlari bo'yicha eksklyuziv xromatografiya bo'yicha aniqlash to'g'risida haqiqat va afsonalar". Amaliy polimer fanlari jurnali. 131 (7): 40111. doi:10.1002 / ilova.40111.
  22. ^ Ba'zilar, Doniyor; Amarteli, Xadar; Tsadok, Ayala; Lebendiker, Mario (2019 yil 20-iyun). "Ko'p burchakli nur sochish bilan birlashtirilgan (SEC-MALS) oqsillarni o'lchov-chiqarib tashlash xromatografiyasi bilan tavsiflash". Vizual eksperimentlar jurnali. doi:10.3791/59615. Olingan 10 oktyabr, 2020.
  23. ^ Herold KE, Rasooly A (2009). Chip texnologiyasi bo'yicha laboratoriya: Biyomolekulyar ajratish va tahlil. 2. Norfolk, Buyuk Britaniya: Horizon Scientific Press. p. 170. ISBN  9781904455462. OCLC  430080586.

Tashqi havolalar

Kutubxona resurslari haqida
Jel o'tkazuvchanligi xromatografiyasi